Biomarcadores ecotoxicológicos em animais de vida aquática

Abstract

Esta dissertação apresenta estudos sobre os efeitos de diferentes contaminantes ambientais usando o robalo (Dicentrarchus labrax L.), e o caranguejo (Carcinus maenas L.) como modelos biológicos e espécies representativas da fauna da Ria de Aveiro e das zonas costeiras de Aveiro. Este estudo centrou-se, fundamentalmente, na investigação das respostas de fase I e II da biotransformação e dos efeitos genotóxicos induzidos por um composto flavonoide sintético (??-naftoflavona (BNF)), por 3 hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs: naftaleno, benzo(a)pireno (B(a)P) e reteno), por 2 ácidos resínicos (ARs: ácido abiético (AA) e ácido desidroabiético (ADA)), pela fracção hidrossolúvel de um efluente industrial e urbano (EIU), por amostras de águas contaminadas pela intensa actividade portuária, e pela amostra de águas da Ria de Aveiro receptoras de um efluente da indústria de pasta de papel com tratamento secundário (EIPP-TS).Os biomarcadores adoptados foram: (1) indicadores de activação da fase I da biotransformação - actividade de etoxiresorufina O-desetilase (EROD) e conteúdo em citocromo P450 (P450) hepáticos; (2) indicadores de activação da fase II da biotransformação - actividades de glutationa S-transferase (GST) e UDP glucuronosil transferase (UDP-GT) hepáticas; (3) determinação de metabolitos de HPAs - concentração de metabolitos do tipo B(a)P e naftaleno na bílis e citosol hepático; (4) um indicador de lesões hepáticas - actividade alanina aminotransferase (ALT) hepática; (5) um indicador da condição geral - índice hepato-somático (IHS); (6) indicadores de genotoxicidade - frequência de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE), frequência de micronúcleos eritrocíticos (MNE) e integridade do ADN hepático. A comparação das respostas do robalo e do caranguejo expostos a ?BNF demonstrou que estas espécies apresentam induções percentuais da actividade de EROD semelhantes. Contudo, os resultados sobre a actividade de EROD obtidos a partir do hepatopâncreas dos caranguejos estão próximos do limite de detecção da técnica utilizada. Nos robalos expostos a BNF, verificou-se um aumento das frequências de MNE e ENA devido à forte indução da actividade de EROD, bem como do conteúdo em P450 hepático, associado a uma saturação da fase II de biotransformação, nomeadamente a actividade de UDP-GT hepática. A concentração de metabolitos não- -conjugados (reactivos) no fígado e no sangue, em resultado da conjugação ineficaz, serão responsáveis, respectivamente, pela crescente inibição da actividade EROD hepática e pelo aparecimento crescente de anomalias nucleares eritrocíticas. Os estudos in vitro apresentados nesta dissertação, demonstram que a BNF inibe a actividade de EROD dos microsomas hepáticos de robalos. Todos os contaminantes ambientais modelo investigados, i.e. os 3 HPAs (naftaleno, B(a)P e reteno) e os 2 ácidos resínicos (AA e ADA), se revelaram mais genotóxicos para os robalos juvenis do que a BNF (B(a)P e ADA>AA>naftaleno>BNF). A não inclusão do reteno, na ordenação acima indicada foi propositada e é devida à utilização limitada deste composto na presente dissertação. Nos estudos in vivo e in vitro, o naftaleno não alterou a actividade de EROD hepática, enquanto que nas exposições dos robalos ao AA e reteno essa actividade foi inibida. No entanto, o aumento da actividade de EROD foi observado após exposição dos robalos a baixas e elevadas concentrações de B(a)P e a baixas concentrações de DHAA. Contudo, nenhum destes compostos ambientais modelo revelou um potencial de indução da actividade de EROD hepática tão elevado quanto o aumento induzido pela BNF. Além do mais, para as concentrações mais elevadas de B(a)P e ADA ou para tempos de exposição mais longos, a actividade de EROD hepática parece ser diminuída. O estudo dos efeitos in vitro do B(a)P demonstra uma inibição da actividade de EROD hepática. Um estudo realizado in vivo revela que a genotoxicidade do B(a)P é devida a uma conjugação ineficaz dos seus metabolitos com a glutationa, uma vez que ocorre uma elevada concentração hepática de metabolitos supostamente não-conjugados, apesar da eliminação e acumulação dos seus conjugados na vesícula biliar. Esse aumento no fígado poderá ser responsável pela inibição das actividades de EROD e GST hepáticas observada nos robalos juvenis expostos a B(a)P. Nas exposições dos robalos às águas portuárias e à fracção hidrossolúvel do EIU a actividade de EROD não foi significativamente alterada, enquanto que nas exposições às águas contaminadas pelo EIPP-TS essa actividade foi inibida. As águas portuárias e as águas receptoras do EIPP-TS na Ria de Aveiro, bem como o EIU, promoveram um aumento significativo das frequências de MNE e ANE nos robalos, o qual demonstra a sua elevada genotoxicidade. Além do mais, o EIU induziu um decréscimo significativo da integridade do ADN hepático. A exposição dos robalos juvenis ao EIU também revelou que os seus efeitos genotóxicos se encontram associados a uma conjugação e eliminação ineficazes, uma vez que os metabolitos de B(a)P e naftaleno não foram conjugados nem acumulados na vesícula biliar, sendo concentrados no fígado. Os resultados apresentados sugerem que a introdução no meio aquático dos contaminantes ambientais investigados constitui um sério risco para as espécies em crescimento e desenvolvimento. Assim, as populações aquáticas da Ria e da área costeira de Aveiro poderão estar sujeitas a acções tóxicas, fundamentalmente ao nível do material genético e de processos fisiológicos vitais, que se poderão reflectir posteriormente ao nível da reprodução e da sobrevivência. O conjunto de parâmetros analisados pode constituir uma bateria de biomarcadores que oferece consideráveis garantias de eficácia na biomonitorização de diversos tipos de contaminação aquática. As frequências de MNE e ANE em robalos juvenis demonstraram uma elevada utilidade, sensibilidade e fiabilidade como indicadoras da presença de compostos genotóxicos na água, revelando serem aplicáveis a todos os contaminantes testados na presente dissertação.

In the present study, the effects of different environmental contaminants were studied using the juvenile sea bass (Dicentrarchus labrax L.) and crab (Carcinus maenas L.) as biological models and representative species of the Aveiro Lagoon and Aveiro coastal waters. This study is mainly focused on phase I and II biotransformation and genotoxicity induction by a synthetic flavonoid (?-naphthoflavone (BNF)), 3 polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs: naphthalene, benzo(a)pyrene (B(a)P) and retene), 2 resin acids (RAs: abietic acid (AA) and dehydroabietic acid (DHAA)), the water soluble fraction of an industrial and urban effluent (IUE), the contaminated Aveiro harbour waters (LTW and HTW ), and the Aveiro Lagoon secondary treated pulp and paper mill effluent (ST-PPME). The biomarkers used were: (1) liver phase I biotransformation induction - liver ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) activity and cytochrome P450 (P450) content; liver phase II biotransformation induction - liver glutathione S-transferase (GST) activity and UDP glucuronosyl transferase (UDP-GT) activity; (3) PAH-type metabolites quantification- B(a)P- and naphthalene-type metabolites concentrations in bile and hepatic cytosol; (4) liver alanine aminotransferase (ALT) activity as an indicator of hepatic lesions; (5) an health condition indicator - liver somatic index; (6) genotoxicity indicators - erythrocytic micronuclei (EMN) and nuclear abnormalities (ENA) frequencies as well as liver DNA integrity. Sea bass liver and crab hepatopancreas responses to BNF, concerning EROD activity induction, showed that both species revealed similar enzymatic increases. However, those results, concerning crab hepatopancreas EROD activity, are close to their method detection limit. The EMN and ENA frequency induction promoted by BNF in sea bass was associated with a strong liver EROD activity and P450 increase as well as phase II conjugation enzymes exhaustion and/or inhibition, namely liver UDP -GT activity. The BNF reactive metabolites increase in liver and blood, due to conjugation failure, may be then responsible for liver enzymatic inhibition as well as for erythrocytic nuclear abnormalities. All the model environmental contaminants, i.e. the 3 PAHs (naphthalene, B(a)P and retene) and the 2 RAs (AA and DHAA), were highly more genotoxic to juvenile sea bass than BNF (B(a)P and DHAA>AA>naphthalene>BNF). Retene was not included, since it was poorly investigated in the present research work. Naphthalene failed to significantly induce liver EROD activity either in vivo or in vitro, whereas liver EROD activity was significantly inhibited in sea bass exposed to AA and retene. Liver EROD activity increase was observed after sea bass exposure to low and very high B(a)P and low DHAA concentrations. However, none of those two compoundsrevealed a strong liver EROD potential compared to BNF. Furthermore, liver EROD activity was decreased by high B(a)P and DHAA concentrations as well as longer exposure lengths. Moreover, B(a)P inhibition of microsomal liver EROD activity was demonstrated in vitro. B(a)P genotoxic potential is due to conjugation failure, since its non-conjugated metabolites increased in live r, despite the elimination and accumulation of conjugated metabolites in the gallbladder. Liver B(a)P -type metabolites increase can be responsible by liver EROD and GST activity inhibition observed in juvenile sea bass exposed to B(a)P. Liver EROD activity was not significantly changed in juvenile sea bass exposed to the Aveiro Lagoon harbour waters and IUE water- -soluble fraction, whereas it was significantly inhibited in fish exposed to the waters contaminated by ST-PPME. All these environmental water contaminants and mixtures were highly genotoxic to juvenile sea bass, since they induced a significant EMN and ENA frequency increase. Moreover, liver DNA integrity was significantly decreased in sea bass exposed to the IUE water-soluble fraction. The IUE genotoxic potential was associated with B(a)P - and naphthalene-type metabolites conjugation failure as well as elimination incapacity, since non-conjugated metabolites were found in liver, and were not accumulated in the gallbladder. The results suggest that, the pollutants investigated can be harmful to aquatic species. Therefore, the aquatic populations, from the Aveiro Lagoon and the Aveiro coastal area, can be challenged by toxic agents, which act at the genetic and physiological levels, subsequently affecting species reproduction and survival. The toxicological responses used in the current research work are the basis of a biomarker battery for biomonitoring programs, being suitable for aquatic contamination evaluation, since they offer a good detection efficacy, allowing the assessment of several organic compounds. The EMN and ENA tests demonstrated a high sensitivity, applicability and viability as indicators of the genotoxins presence in water.