Botryosphaericeae and Diaporthaceae species associated with blueberry plants in Portugal

Abstract

The blueberry (Vaccinium corymbosum) is a non-native and increasingly cultivated plant in Portugal and represents an important part of the economy of some regions. The rapid growing of blueberry production has been accompanied by an increase of diseases caused by plant pathogens, mainly fungi. However, there is an overall lack of studies concerning blueberry fungal pathogens occurring in Portugal. This study aimed to contribute to fill this gap by focusing on Diaporthaceae and Botryosphaeriaceae species, which are known pathogens affecting cultivated areas of blueberry worldwide. For this, a collection of 222 fungal isolates obtained from blueberry plants, including asymptomatic and symptomatic, was characterised. All 222 isolates were initially subjected to BOX-PCR fingerprinting to evaluate their overall genetic diversity. From the cluster analysis performed on BOX-PCR fingerprints 81 isolates representative of each cluster were selected for molecular identification, namely by ITS sequencing and analysis. A primary identification based on ITS sequences allowed identifying 13 different genera with Neofusicoccum and Botryosphaeria (Botryosphaeriacaeae) and Diaporthe (Diaporthaceae) being the most common. The isolates identified by ITS sequences as members of Diaporthe, Neofusicoccum and Botryosphaeria were further subjected to multi locus sequence analyses in order to correctly identify them to the species level. Thus, sequences of the translation elongation factor 1-alpha (tef1-α) were obtained for Neofusicoccum and Botryosphaeria isolates. β-tubulin (tub), tef1-α, histone (his), and calmodulin (cal) were also used for multi locus sequence analysis of Diaporthe species. Combined ITS and tef1-α phylogenetic analyses showed that all Botryosphaeria isolates belonged to the species B. dothidea, while Neofusicoccum isolates belonged to three different species, namely N. australe, N. eucalyptorum and N. parvum. Neofusicoccum parvum was the most abundant of all Botryosphaeriacaeae species found. Phylogenetic analyses placed the Diaporthe isolates into distinct clades representing three known species (D. eres, D. foeniculina, and D. rudis) and three putative novel species (Diaporthe sp.1, Diaporthe sp.2, and Diaporthe sp.3), with D. eres and Diaporthe sp. 2 being the most abundant. The putative novel species were fully characterised in terms of morphology, ability to grow at different temperatures and their mating types. Full taxonomic descriptions are given for all of them. Pathogenicity tests using isolates representative of each species showed that all Diaporthe, Neofusicoccum and Botryosphaeria were pathogenic to blueberry plants of the cultivar Bluecrop. Among the Botryosphaeriacaeae species, N. parvum was the most aggressive while Diaporthe sp. 3 was the most aggressive of all Diaporthe species tested. Neofusicoccum parvum was the only species the induced plant death and it is thus regarded as probably the most relevant pathogen of blueberry. This study represents the first confirmation of the occurrence in Portugal of D. eres, D. foeniculina, D. rudis, N. australe, N. parvum and B. dothidea on blueberries. Additionally, N. eucalyptorum, a common Eucalyptus spp. pathogen, is reported worldwide for the first time as a pathogen of blueberry. This represents a relevant host jump whose potential future implications on blueberry plantations are not understood. The results presented show that species of Diaporthe and Botryosphaeriacaeae are common on blueberry plantations in Portugal. Their diversity throughout the country and pathogenicity towards other blueberry cultivars deserve further studies.

O mirtilo (Vaccinium corymbosum) é uma planta não nativa, cujo cultivo em Portugal tem crescido representando uma parte importante da economia em algumas regiões do país. O crescimento rápido da produção tem sido acompanhado por um aumento de doenças causadas por agentes fitopatogénicos, particularmente fungos. No entanto, os estudos sobre fungos patogénicos de mirtilo em Portugal são muito escassos. Este estudo pretendeu contribuir para colmatar esta falha, focando as espécies de Diaporthaceae e Botryosphaeriaceae pois são reconhecidas como agentes patogénicos que afetam plantações de mirtilo a nível mundial. Para tal foi caracterizada uma coleção de 222 isolados fúngicos obtidos de plantas sintomáticas e assintomáticas. Todos os 222 isolados foram inicialmente submetidos a tipagem por BOX-PCR de modo a avaliar a diversidade genética global da coleção. A partir da análise dos perfis BOXPCR foram selecionados 81 isolados representativos para identificação molecular por sequenciação e análise da região ITS. A identificação inicial baseada nas sequências da região ITS permitiu a identificação de 13 géneros distintos. De entre estes, Neofusicoccum e Botryosphaeria (Botryosphaeriacaeae) e Diaporthe (Diaporthaceae) foram os mais abundantes. Os isolados pertencentes aos géneros Diaporthe, Neofusicoccum e Botryosphaeria foram adicionalmente sujeitos a uma análise de sequências multi locus de modo a permitir a sua identificação correta ao nível da espécie. Foram obtidas sequências do gene que codifica para o fator de alongamento da transcrição 1-alfa (tef1-α) para os isolados de Neofusicoccum e Botryosphaeria. As sequências dos genes que codificam para β-tubulina (tub), tef1-α, histona (his) e calmodulina (cal) foram utilizadas para uma análise multi locus das espécies de Diaporthe. A análise filogenética das sequências ITS e tef1-α combinadas revelou que os isolados de Botryosphaeria pertenciam todos à espécie B. dothidea, enquanto os isolados de Neofusicoccum pertenciam a três espécies diferentes, nomeadamente N. australe, N. eucalyptorum e N. parvum. Neofusicoccum parvum foi a mais abundante de todas as espécies de Botryosphaeriacaeae identificadas. As análises filogenéticas permitiram alocar os isolados de Diaporthe a diferentes clados, representando 3 espécies conhecidas (D. eres, D. foeniculina, e D. rudis) e três potenciais novas espécies (Diaporthe sp.1, Diaporthe sp.2, e Diaporthe sp.3). De todas estas, D. eres e Diaporthe sp. 2 foram as mais abundantes. As três potenciais novas espécies foram caracterizadas em termos morfológicos, capacidade de crescimento a diferentes temperaturas e tipos de mating. São apresentadas descrições taxonómicas completas para cada uma delas. Em testes de patogenicidade usando isolados representativos de cada espécie, todas as espécies de Diaporthe, Neofusicoccum e Botryosphaeria mostraram ser patogénicas para plantas de mirtilo da cultivar Bluecrop. Neofusicoccum parvum foi a mais agressiva das espécies de Botryosphaeriacaeae, enquanto Diaporthe sp. 3 foi a mais agressiva das espécies de Diaporthe testadas. Neofusicoccum parvum foi a única espécie que causou mortalidade de plantas sendo por isso considerada possivelmente como o agente patogénico mais relevante em mirtilo. Este estudo representa a primeira confirmação da ocorrência, em Portugal, de D. eres, D. foeniculina, D. rudis, N. australe, N. parvum e B. dothidea em mirtilo. Adicionalmente, N. eucalyptorum, um agente patogénico comum de Eucalyptus spp., é reportado pela primeira vez como agente patogénico de mirtilo a nível mundial. Tal facto representa uma mudança para um novo hospedeiro cujas potenciais implicações futuras em plantações de mirtilo não são conhecidas. Os resultados apresentados mostram que as espécies de Diaporthe e Botryosphaeriacaeae são comuns em mirtilo em Portugal. A sua diversidade ao longo do país bem como a sua patogenicidade em relação a outras cultivares de mirtilo merecem ser exploradas no futuro.