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Title: Characterization of the selective potential for the improvement of Cry toxins with nematicidal activity
Other Titles: Caracterização do potencial selectivo para o melhoramento de toxinas Cry nematicidas
Author: Delgadinho, Mariana Isabel Neves
Advisor: Pereira, Maria de Lourdes Gomes
Perfeito, Lilia de Fátima Gomes
Chelo, Ivo Manuel Mimoso Vieira
Keywords: Nemátodos
Toxinas
Defense Date: 12-Dec-2017
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Cry proteins are naturally produced by Bacillus thuringiensis, a gram-positive spore-forming bacterium, which exhibit specific toxicity against a variety of insects and nematodes. The toxins produced are known to be highly efficient, completely biodegradable and harmless to humans and other vertebrates. All of these reasons make them an excellent alternative to the chemical pesticides currently used. The main goal of the present work was to characterize and evaluate the potential to improve a Cry protein (Cry21Fa1) against nematodes. In order to fulfil this aim, the protein was expressed in the Escherichia coli JM103 strain and given to Caenorhabditis elegans as food source. Several experiments were designed, such as: toxin efficiency tests, characterization of toxic components, bacterial fitness measurements, assessment of the bacterial genetic background impact, site-directed mutagenesis and toxin testing on pathogenic nematodes. The results of the present study demonstrated that Cry21Fa1 is a very efficient toxin in reducing the C. elegans growth rate and consequently providing a higher fitness to the bacteria expressing it. The affected worms have a slower development time, lay eggs later and the chances of survival were decreased. Additionally, with the mutagenesis procedure we were able to demonstrate that a specific region on Domain III of the protein is crucial for the toxin function, probability affecting the receptor binding affinities or structural integrity. This is the first mutation analysis performed on this Cry21 gene, hopefully contributing to a better understanding of their mode of action. However, further work of this kind will be needed in order to efficiently improve the toxin. Our ability to confer and control the function of proteins via genetic engineering has significantly improved our understanding of protein structure-function relationships and led to the creation of novel molecules of economic interest, in order to enhance human life. Given the increasing demand for eco-friendly products, the development of additional Cry products should be encouraged.
As proteínas Cry são naturalmente produzidas por Bacillus thuringiensis, uma bactéria gram-positiva formadora de esporos que exibe uma toxicidade específica contra uma variedade de insetos e nemátodes. As toxinas produzidas são conhecidas por serem altamente eficientes, biodegradáveis e inofensivas a humanos e outros vertebrados. Tudo isso, faz com que sejam uma excelente alternativa aos pesticidas químicos atualmente utilizados. O objetivo principal deste trabalho foi caracterizar e avaliar o potencial para melhorar uma proteína Cry (Cry21Fa1), com atividade contra nemátodes. De forma a alcançarmos esse objetivo, a proteína foi transformada e expressa numa bactéria Escherichia coli JM103 e dada como fonte de alimento aos Caenorhabditis elegans. Para o efeito foram realizadas uma grande variedade de experiências, tais como: ensaios de eficiência da toxina, caracterização dos componentes tóxicos, medição do fitness bacteriano, avaliação do impacto do background genético bacteriano, mutagénese dirigida e testes da toxina em nemátodes patogénicos. Os resultados do presente trabalho demonstraram que a Cry21Fa1 é uma toxina bastante eficiente, reduzindo significativamente a taxa de crescimento dos C. elegans e consequentemente aumentando o fitness da bactéria que a expressa. As larvas afetadas apresentam um desenvolvimento retardado, colocam ovos mais tarde e as hipóteses de sobrevivência diminuem. Adicionalmente, com o procedimento de mutagénese foi possível demonstrar que uma região específica no Domínio III da proteína, é de extrema importância para a funcionalidade da toxina, provavelmente afetando a afinidade da ligação do recetor ou integridade estrutural. Esta foi a primeira análise mutacional realizada nesta proteína, contribuindo possivelmente para uma melhor perceção do seu modo de ação. No entanto, serão necessários futuros estudos de forma a melhorarmos eficientemente esta toxina. A habilidade de conferir e controlar a função de proteínas através da engenharia genética tem proporcionado um conhecimento mais aprofundado sobre as relações proteicas estrutura-função e levou à criação de novas moléculas de interesse económico, que têm como objetivo principal melhorar a qualidade de vida humana. Dado o aumento da necessidade por produtos sem impacto ambiental, o desenvolvimento de novos produtos Cry deve ser encorajado.
Description: Mestrado em Biologia Molecular e Celular
URI: http://hdl.handle.net/10773/21412
Appears in Collections:DBio - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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