Influência da temperatura e tempo de cultura na produção de lípidos de interesse biotecnológico e na bioquímica de duas diatomáceas

Abstract

As microalgas são um grupo de organismos extremamente diversificado presente em quase todos os ambientes e desempenhando um papel determinante no funcionamento dos ecossistemas a nível global. As diatomáceas (Bacillariophyceae) são dos grupos de microalgas que apresentam maior flexibilidade ambiental sendo responsáveis por 20 % da fixação mundial de carbono e consideradas as principais produtoras primárias no oceano. A capacidade que as microalgas demonstram em adaptar-se a diversas condições ambientais está em grande parte ligada à capacidade de alterar o seu metabolismo, sobretudo o metabolismo lipídico. Nas diatomáceas, assim como na generalidade das microalgas, as condições de cultura como a temperatura, luminosidade, disponibilidade em nutrientes ou pH afetam o crescimento e a composição bioquímica da biomassa (conteúdos em lípidos, ácidos gordos, proteínas e hidratos de carbono). Condições de cultivo inadequadas podem levar as células ao estado de stresse oxidativo desencadeado pelo aumento excessivo de espécies reativas de oxigénio (ROS). Nas microalgas o stresse oxidativo está associado à desaceleração do crescimento e aumento do armazenamento de lípidos. O metabolismo dos ácidos gordos é também afetado por fatores ambientais, que regulam a sua síntese. As diatomáceas Nitzschia palea e N. communis foram cultivadas a diferentes temperaturas (20, 30, 33 e 35º C); a cinética de crescimento foi estudada através da contagem do nº de células nos dias 3, 5, 7, 9, 11 e 14 e a biomassa recolhida nos dias 7, 11 e 14 para as análises bioquímicas. A temperatura ótima para o crescimento de N. palea ronda os 30º C ao passo que para N. communis está mais próxima dos 20º C. Temperaturas acima dos 33 e 30º C inibiram fortemente o crescimento respetivamente em N. palea e N. communis. Quanto à composição bioquímica observámos que nas duas espécies, de um modo geral, o cultivo a temperaturas superiores à ótima e quando as células se encontravam em stresse oxidativo, demonstrado pelo aumento dos níveis de peroxidação lipídica (LPO) e carbonilação proteica, os conteúdos celulares em lípidos, proteínas e hidratos de carbono aumentaram. O envelhecimento das culturas teve efeito semelhante nos parâmetros fisiológicos (LPO e carbonilação proteica) e bioquímicos nas duas espécies. O stresse causado por temperaturas demasiado elevadas ou em culturas envelhecidas leva a que a produção de lípidos de reserva seja estimulada. Estes lípidos de reserva, sobretudo na forma de triglicerídeos (TAG), consomem o excesso de fotoassimilados produzidos nestas condições. Estes são armazenados em gotas lipídicas, podendo ser catabolizados para a produção de energia quando as condições voltarem a ser ideais. O aumento do conteúdo de hidratos de carbono em condições de stresse (temperatura e envelhecimento da cultura) pode também ser explicado de dois ângulos. Por um lado este aumento pode refletir o estímulo à produção de crisolaminarina, para o armazenamento de energia. Por outro lado como sabemos que a crisolaminarina tem propriedades antioxidantes o seu aumento pode ser um mecanismo de defesa contra os ROS. O aumento significativo do conteúdo proteico em N. palea em condições que promovem o stresse oxidativo pode ser explicado pelo aumento da produção de enzimas antioxidantes associadas ao combate do excesso de ROS e aos seus danos. A influência da temperatura (em N. palea e N. communis) e do tempo de cultura (em N. palea) no perfil em ácidos gordos foi analisada através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). De um modo geral em todas as condições de cultura os ácidos gordos mais abundantes foram C14:0, C16:0, C16:1, C18:0 e C18:1. Em N. palea o cultivo a 33º C provocou o aumento significativo dos ácidos gordos monoinsaturados, isto é explicado pela maior atividade da enzima Δ9-desaturase, responsável pela formação de C16:1 e C18:1, em condições de stresse, aqui provocado por temperatura elevada. Em N. communis os resultados foram contrários, com a percentagem de ácidos gordos monoinsaturados a diminuir à temperatura causadora de stresse (30º C). Está provado que os lípidos das diatomáceas podem ser explorados para as mais diversas aplicações, como para a produção de biocombustíveis, produtos alimentares, fármacos ou cosméticos. A produção de lípidos por estas duas espécies de diatomáceas é aqui estudada na perspetiva do seu aproveitamento biotecnológico. Neste sentido identificámos dois produtos de interesse, derivados dos lípidos, o biodiesel e o ácido palmitoleico. As condições de temperatura e tempo de cultura podem ser manipuladas para se obter o conteúdo em lípidos e perfil em ácidos gordos ideal para cada um destes produtos. Concluímos que para a produção de biodiesel a espécie que reúne melhores condições é a N. communis quando cultivada a 30º C com colheita no dia 7. Já para a produção de ácido palmitoleico a espécie mais adequada é a N. palea cultivada a 30º C, colhida no dia 11.

Microalgae are a very diverse group of organisms present in almost all environments and performing a crucial and global role on functioning of ecosystems. Diatoms (Bacillariophyceae) are one of the groups of microalgae with great capacity of adaptation to various environments. They are responsible for 20% of global carbon fixation, and are known as principal primary producers in oceans. Microalgae’s ability to adapt to different environmental conditions is due to their capacity to change their metabolism, specially lipidic metabolism. In microalgae in general and diatoms in particular, culture conditions such as temperature, luminosity, availability of nutrients, or pH affect growth and biochemical composition of biomass (lipid content, fatty acids, proteins and carbohydrates). Inadequate culture conditions can lead cells to oxidative stress due to excessive increase of reactive oxygen species (ROS). In microalgae, oxidative stress is linked to growth mitigation and increase of lipid storage. Fatty acids’ metabolism is also affected by environmental factors which regulate its synthesis. Diatoms Nitzschia palea and Nitzschia communis were cultivated at different temperatures (20, 30, 33 and 35ºC), growth kinetics was investigated through countingof cells at days 3, 5, 7, 9, 11 and 14, and its biomass was collected at days 7, 11 and 14 for biochemical analysis. Optimum growth temperature for N. palea was about 30ºC, while N. communis presented a temperature closer to 20ºC. Temperatures above 33 and 30ºC strongly inhibited growth in N palea and N. communis, respectively. Relatively to biochemical composition, in general, we observed an increase in lipid, protein and carbohydrate content in both species shown by an increase in lipid peroxidation (LPO) and protein carbonylation, when cells were subjected to temperatures aboven optimum. Culture aging had a similar effect in physiologic (LPO and protein carbonylation) and biochemical parameters in both species. Stress conditions (high temperatures and culture aging) lead to stimulation of production and storage of lipids. These lipids are forms of TAGs and consume the excess of photoassimilates produced in these conditions. The TAGs are stored in lipid droplets and can be catabolized for energy production when conditions become ideal again. The increase of carbohydrates in stress conditions (temperature and culture aging) can be explained from two points of view. On one hand, that increase can reflect the stimuli for chryslaminarin production (storage of energy). On the other hand, it is known that chrysolaminarin has antioxidant properties and its increase in cells can be a defence mechanism against ROS. The significant increase in protein content in N. palea (in conditions promoting oxidative stress) is explained by the increase of antioxidant enzyme associated to action against ROS excess and its damage. Temperature (on N. palea and N. communis) and culture period (in N. palea) influence fatty acid profile whichwas analysed through gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). In general, the most abundant fatty acids were C14:0, C16:0, C16:1, C18:0 and C18:1. N. palea at 33ºC showed a significant increase in monounsaturated fatty acids and this is explained by higher activity of enzyme Δ9-desaturase, responsible for formation of C16:1 and C18:1 in stress conditions (high temperature). In N. communis, the results were opposite, showing lower percentage of monounsaturated fatty acids at 33ºC (stressing temperature). It is proved that diatom lipids can be explored for diverse applications, such as biodiesel production, food, pharmaceuticals or cosmetics. Lipid production from these two diatoms (N. palea and N. communis) is here studied for biotechnological use. In this sense, we identified two products of interest derived from diatom lipids: biodiesel and palmitoleic acid. Temperature and culture aging conditions can be manipulated for obtaining ideal lipid content and fatty acid profile for each of these products. We also concluded that for biodiesel production, N. communis is the species which presents the best results when growing at 30ºC with harvest at day 7. For production of palmitoleic acid, the best species is N. palea growing at 30ºC and harvest at day 7.