Functional characterization of novel BRI2 and BRI3 complexes

Abstract

A BRI2 e a BRI3 são proteínas transmembranares de tipo II cujas funções fisiológicas ainda não se encontram bem caracterizadas. Duas mutações autossómicas dominantes no gene BRI2 estão na origem de duas formas de demência rara: Demência Familiar Britânica e Demência Familiar Dinamarquesa. Estas partilham características clinicas e neuropatológicas com a doença de Alzheimer, nomeadamente deposição de proteínas anormais no cérebro. Apesar de nunca ter sido associada a qualquer doença, a BRI3 está enriquecida no sistema nervoso central o que sugere que possa ter uma função neuronal. Interações proteína-proteína têm adquirido uma importância crescente no estudo de funções de proteínas e vias de sinalização subjacentes. Neste trabalho, foram identificadas novas interações entre a BRI2 e a proteína fosfatase 1 (PP1), bem como entre a BRI3 com a PP1. A PP1 é a uma importante fosfatase serina/treonina presente em organismos eucariotas, onde se estima que seja capaz de catalisar a maioria dos eventos de defosforilação. Adicionalmente, determinámos a BRI2 e BRI3 como substratos da PP1, e identificámos os motivos RVxF presentes nos seus N-terminais como responsáveis pela ligação à PP1. A relevância fisiológica do complexo BRI2:PP1 foi investigada, e demonstrámos pela primeira vez que a fosforilação da BRI2, nomeadamente a defosforilação pela PP1, é um mecanismo de regulação do seu processamento proteolítico. Estabelecemos ainda uma relação entre os níveis de fosforilação da BRI2 com a diferenciação de processos neuronais, onde a fosforilação da proteína total parece estar envolvida no surgimento de processos neuronais, enquanto o fragmento Nterminal resultante do seu processamento parece estar relacionado com o elongamento e estabilização dos processos neuronais. No decorrer do trabalho, identificámos e caracterizámos os interactomas das proteínas BRI2 e BRI3 em cérebro, recorrendo a co-imunoprecipitações e identificação das proteínas por espectrometria de massa. Análise in silico do interactome da BRI2 reforçou os nossos resultados sugerindo um papel para esta proteína na diferenciação neuronal, e vários mecanismos subjacentes foram evidenciados. Adicionalmente, a análise dos interactomas localiza ambas proteínas na sinapse (pré e pós-sinapse). Esta evidência juntamente com a descoberta de interações com proteínas estruturais destes compartimentos celulares, nomeadamente a PSD-95, sugere um papel importante para ambas as proteínas em sinalização e transmissão sináptica. Assim, os nossos resultados compreendem informação importante para estudos futuros acerca da biologia das proteínas BRI2 e BRI3, e mecanismos celulares envolvidos, bem como na sua associação com o desenvolvimento de neuropatologias.

BRI2 and BRI3 are type II transmembrane protein family members whose physiological functions are poorly understood. Two different autosomal dominant mutations in the BRI2 gene are responsible for the development of two rare early-onset forms of dementia: Familial British and Familial Danish dementias that share clinical and neuropathological characteristics with Alzheimer´s disease, involving abnormal proteins’ deposition in the brain. For BRI3 no disease association has been established so far, nevertheless, its enriched expression in the central nervous system strongly suggests a role for BRI3 in neuronal function. Protein-protein interactions are becoming increasingly important in the study of protein function and underlying signaling pathways. In this work, both BRI2 and BRI3 were identified as novel protein phosphatase 1 (PP1) interacting proteins. PP1 is the major Ser/Thr protein phosphatase present in eukaryotic organisms, which catalyses the majority of protein dephosphorylation events. Moreover, we were able to determine BRI2 and BRI3 as PP1 substrates, which bind to the latter through an RVxF-like motif located in their N-terminal part. The physiological relevance of BRI2:PP1 complex was pursued, and we provide for the first time evidence suggesting that BRI2 phosphorylation, namely via PP1 dephosphorylation, is a regulatory mechanism for its proteolytic processing. Further, a correlation between BRI2 phosphorylation and neurite outgrowth was established. The phosphorylation of full-length protein seems to promote the emergence of neurites whereas the increased BRI2 N-terminal processing fragment plays a role in neurites’ elongation and stabilization. Herein, we also identified and characterized the interactome of both BRI2 and BRI3 in the brain using co-immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis. In silico analysis of the BRI2 interactome strengthened our results suggesting a role in neuronal differentiation and some underlying mechanisms were pointed out. Moreover, interactomes’ analysis suggested the presence of both BRI2 and BRI3 at synapses (pre- and post-synapse). This finding together with their ability to form complexes with structural constituents of these compartments, namely PSD-95 suggested an important role for both proteins in synaptic signaling and synaptic transmission. Thus, our results provide valuable information for further studies on BRI2 and BRI3 biology, and potential underlying molecular mechanisms, as well as associations with neuropathologies.