New polymerization routes for plasmonic nanostructured assemblies

Abstract

Este trabalho descreve a preparação e caracterização de nanoestruturas funcionais de ouro do tipo coroa@núcleo para aplicações em biodeteção. O trabalho foi desenvolvido considerando duas abordagens principais na preparação de nanoestruturas polímero@Au (coroa@núcleo), nomeadamente utilizando: (i) polímeros disponíveis comercialmente e (ii) polímeros sintetizados por polimerização radicalar controlada, mais especificamente por polimerização de transferência de cadeia reversível por adição-fragmentação (RAFT). Foram também exploradas estratégias para a funcionalização destas nanoestruturas a fim de avaliar a sua potencialidade e especificidade em biodeteção. Neste sentido, o sistema modelo utilizado para estudar a resposta à biodeteção foi o de biotina-avidina (receptor –analito) e, como controlo, a albumina do soro de bovino (BSA). No primeiro capítulo apresenta-se uma revisão bibliográfica dos tópicos abordados ao longo desta tese. Inicialmente é apresentada uma contextualização do trabalho onde é realçada a importância das propriedades óticas das nanopartículas (NPs) de ouro em aplicações biológicas. Seguidamente é dada ênfase à modificação e funcionalização de NPs de ouro tendo em vista precisamente este tipo de aplicações. Nesse sentido, foram analisadas criticamente as duas principais abordagens consideradas no âmbito desta tese. Uma primeira em que foram usados polímeros iónicos (polielectrólitos) disponíveis comercialmente para a modificação de NPs através de interações electrostáticas usando o método camada a camada (LbL). Numa segunda abordagem, com maior relevância neste trabalho, foram revistas estratégias para preparação de nanoestruturas de ouro utilizando o mecanismo de polimerização RAFT. Finalmente foi abordada a técnica Langmuir Blodgett (LB) no estudo de moléculas anfifílicas na interface ar/água e na preparação de filmes LB. No segundo capítulo apresentam-se os resultados obtidos relativos à utilização do método LbL na preparação das nanoestruturas de ouro. Assim, foram preparadas nanoestruturas do tipo coroa@núcleo usando o policatião hidrocloreto de polialilamina (PAH) e o polianião sulfonato de poliestireno (PSS), funcionalizadas com biotina e um fluoróforo (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e utilizando duas vias destintas. As nanoestruturas foram caracterizadas por espectroscopia no UV-Visível e de fluorescência, por medidas de potencial zeta e microscopia eletrónica. Por fim, a resposta ótica e a especificidade da resposta das nanoestruturas funcionalizadas à presença de avidina foi estudada por espectroscopia no UV-Visível e fluorescência. No terceiro capítulo foram exploradas três estratégias para a preparação de nanoestruturas do tipo coroa@núcleo usando polímeros sintetizados por polimerização RAFT. Primeiramente foram polimerizados monómeros hidrofílicos (acrilato de poli(etileno glicol) metil éter (PEGA) e ácido acrílico (AA) em solução, usando o mecanismo de polimerização RAFT, obtendo-se Este trabalho descreve a preparação e caracterização de nanoestruturas funcionais de ouro do tipo coroa@núcleo para aplicações em biodeteção. O trabalho foi desenvolvido considerando duas abordagens principais na preparação de nanoestruturas polímero@Au (coroa@núcleo), nomeadamente utilizando: (i) polímeros disponíveis comercialmente e (ii) polímeros sintetizados por polimerização radicalar controlada, mais especificamente por polimerização de transferência de cadeia reversível por adição-fragmentação (RAFT). Foram também exploradas estratégias para a funcionalização destas nanoestruturas a fim de avaliar a sua potencialidade e especificidade em biodeteção. Neste sentido, o sistema modelo utilizado para estudar a resposta à biodeteção foi o de biotina-avidina (receptor –analito) e, como controlo, a albumina do soro de bovino (BSA). No primeiro capítulo apresenta-se uma revisão bibliográfica dos tópicos abordados ao longo desta tese. Inicialmente é apresentada uma contextualização do trabalho onde é realçada a importância das propriedades óticas das nanopartículas (NPs) de ouro em aplicações biológicas. Seguidamente é dada ênfase à modificação e funcionalização de NPs de ouro tendo em vista precisamente este tipo de aplicações. Nesse sentido, foram analisadas criticamente as duas principais abordagens consideradas no âmbito desta tese. Uma primeira em que foram usados polímeros iónicos (polielectrólitos) disponíveis comercialmente para a modificação de NPs através de interações electrostáticas usando o método camada a camada (LbL). Numa segunda abordagem, com maior relevância neste trabalho, foram revistas estratégias para preparação de nanoestruturas de ouro utilizando o mecanismo de polimerização RAFT. Finalmente foi abordada a técnica Langmuir Blodgett (LB) no estudo de moléculas anfifílicas na interface ar/água e na preparação de filmes LB. No segundo capítulo apresentam-se os resultados obtidos relativos à utilização do método LbL na preparação das nanoestruturas de ouro. Assim, foram preparadas nanoestruturas do tipo coroa@núcleo usando o policatião hidrocloreto de polialilamina (PAH) e o polianião sulfonato de poliestireno (PSS), funcionalizadas com biotina e um fluoróforo (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e utilizando duas vias destintas. As nanoestruturas foram caracterizadas por espectroscopia no UV-Visível e de fluorescência, por medidas de potencial zeta e microscopia eletrónica. Por fim, a resposta ótica e a especificidade da resposta das nanoestruturas funcionalizadas à presença de avidina foi estudada por espectroscopia no UV-Visível e fluorescência. No terceiro capítulo foram exploradas três estratégias para a preparação de nanoestruturas do tipo coroa@núcleo usando polímeros sintetizados por polimerização RAFT. Primeiramente foram polimerizados monómeros hidrofílicos (acrilato de poli(etileno glicol) metil éter (PEGA) e ácido acrílico (AA) em solução, usando o mecanismo de polimerização RAFT, obtendo-se Este trabalho descreve a preparação e caracterização de nanoestruturas funcionais de ouro do tipo coroa@núcleo para aplicações em biodeteção. O trabalho foi desenvolvido considerando duas abordagens principais na preparação de nanoestruturas polímero@Au (coroa@núcleo), nomeadamente utilizando: (i) polímeros disponíveis comercialmente e (ii) polímeros sintetizados por polimerização radicalar controlada, mais especificamente por polimerização de transferência de cadeia reversível por adição-fragmentação (RAFT). Foram também exploradas estratégias para a funcionalização destas nanoestruturas a fim de avaliar a sua potencialidade e especificidade em biodeteção. Neste sentido, o sistema modelo utilizado para estudar a resposta à biodeteção foi o de biotina-avidina (receptor –analito) e, como controlo, a albumina do soro de bovino (BSA). No primeiro capítulo apresenta-se uma revisão bibliográfica dos tópicos abordados ao longo desta tese. Inicialmente é apresentada uma contextualização do trabalho onde é realçada a importância das propriedades óticas das nanopartículas (NPs) de ouro em aplicações biológicas. Seguidamente é dada ênfase à modificação e funcionalização de NPs de ouro tendo em vista precisamente este tipo de aplicações. Nesse sentido, foram analisadas criticamente as duas principais abordagens consideradas no âmbito desta tese. Uma primeira em que foram usados polímeros iónicos (polielectrólitos) disponíveis comercialmente para a modificação de NPs através de interações electrostáticas usando o método camada a camada (LbL). Numa segunda abordagem, com maior relevância neste trabalho, foram revistas estratégias para preparação de nanoestruturas de ouro utilizando o mecanismo de polimerização RAFT. Finalmente foi abordada a técnica Langmuir Blodgett (LB) no estudo de moléculas anfifílicas na interface ar/água e na preparação de filmes LB. No segundo capítulo apresentam-se os resultados obtidos relativos à utilização do método LbL na preparação das nanoestruturas de ouro. Assim, foram preparadas nanoestruturas do tipo coroa@núcleo usando o policatião hidrocloreto de polialilamina (PAH) e o polianião sulfonato de poliestireno (PSS), funcionalizadas com biotina e um fluoróforo (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e utilizando duas vias destintas. As nanoestruturas foram caracterizadas por espectroscopia no UV-Visível e de fluorescência, por medidas de potencial zeta e microscopia eletrónica. Por fim, a resposta ótica e a especificidade da resposta das nanoestruturas funcionalizadas à presença de avidina foi estudada por espectroscopia no UV-Visível e fluorescência. No terceiro capítulo foram exploradas três estratégias para a preparação de nanoestruturas do tipo coroa@núcleo usando polímeros sintetizados por polimerização RAFT. Primeiramente foram polimerizados monómeros hidrofílicos (acrilato de poli(etileno glicol) metil éter (PEGA) e ácido acrílico (AA) em solução, usando o mecanismo de polimerização RAFT, obtendo-se polímeros que contêm o agente RAFT e por isso designados de agente macroRAFT (MR). Seguidamente, foi sintetizado um segundo bloco a partir do agente macroRAFT por polimerização RAFT em emulsão de monómeros hidrofóbicos (metacrilato de metilo (MMA) e acrilato de butilo (BA)), obtendo-se os respetivos copolímeros de bloco. Estes copolímeros foram depois utilizados nas duas primeiras estratégias: no caso da estratégia pós-modificação, as NPs de Au, também previamente preparadas, foram misturadas com o copolímero, enquanto que na estratégia in situ as NPs de ouro foram sintetizadas na presença do copolímero. Na terceira estratégia, o segundo bloco (bloco hidrofóbico) foi preparado a partir do agente macroRAFT previamente adsorvido à superfície das NPs de Au (MR@Au NPs). Nesta última estratégia foram identificados e otimizados alguns parâmetros que permitiram obter nanoestruturas do tipo copolímero@Au, como por exemplo a adição controlada dos monómeros hidrofóbicos, bem como a concentração de MR. No quarto capítulo selecionou-se o tipo de nanoestrutura de copolímero@Au mais promissor obtido no capítulo anterior para ser funcionalizado e utilizado em ensaios de bioreconhecimento. As nanoestruturas de copolímero@Au foram funcionalizadas com biotina utilizando a química click e avaliou-se a resposta ótica e especificidade na presença de avidina. Visando compreender o modo de interação ao nível molecular entre o copolímero (funcionalizado, ou não, com biotina) e o bioanalito, foram realizados alguns estudos preliminares sobre o comportamento destes polímeros na interface ar/água utilizando a técnica Langmuir-Blodgett (LB). Adicionalmente, foram ainda preparadas nanoestruturas fluorescentes de copolímero@Au por polimerização RAFT de um monómero fluorescente (monómero modificado com FITC) a partir da superfície das MR@Au NPs e seguidamente de monómeros hidrofóbicos (MMA:BA), de modo a avaliar o efeito da distância entre o núcleo e o fluoróforo sobre a resposta ótica deste tipo de nanoestruturas. As diferentes estratégias de preparação de nanoestruturas de ouro desenvolvidas ao longo desta tese permitiram estabelecer soluções para diversos aspetos críticos tais como a robustez, o controlo da morfologia e a estabilidade coloidal de nanoestruturas do tipo polímero@Au para aplicações em biodeteção, bem como estabelecer procedimentos com vista à sua funcionalização. A utilização do mecanismo RAFT utilizando a estratégia de polimerização a partir da superfície demonstrou ser particularmente útil para a encapsulação e (multi)funcionalização de NPs de ouro, e apresenta-se como estratégia promissora na aplicação a outros nanomateriais.

This thesis describes the preparation and characterization of multifunctional gold shell@core nanostructures towards biosensing applications. The work was developed following two different approaches for the preparation of the polymer@Au (shell@core) nanostructures, using (i) commercially available polymers and (ii) polymers synthesized via reversible deactivation radical polymerization, specifically reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT). Strategies aiming at the functionalization of these nanostructures were also explored in order to assess their potential use in biosensing using the biotin-avidin (bioreceptor-bioanalyte) system as model and bovine serum albumin (BSA) as control. In the first chapter, a literature review concerning the main topics discussed in this thesis is presented. Initially, the work developed in this thesis is put in context highlighting the optical properties of gold nanoparticles (NPs) in biological applications and the strategies available for the modification and functionalization of Au NPs aiming at this type of applications. In that sense, two main approaches were reviewed considering the work developed in the thesis namely: the use of commercially available ionic polymers (polyelectrolytes) to modify NPs surface via electrostatic interactions using the Layer-by-Layer (LbL) method, and the preparation of gold nanostructures mediated by RAFT polymerization. Finally, the Langmuir Blodgett (LB) technique was a briefly presented for the study of amphiphilic molecules at air/water interface and in the preparation of LB films. In the second chapter, the results obtained regarding the preparation of Au nanostructures using the LbL method are presented. The shell@core type nanostructures were prepared using the polycation poly(allylamine hydrochloride) (PAH) and the polyanion poly(sodium styrene sulfonate) (PSS) and were functionalized with biotin and a fluorophore (fluorescein isothiocyanate – FITC) following two distinct paths. The nanostructures were characterized by UV-Visible and fluorescence spectroscopy, zeta potential measurements and electron microscopy. Finally, the optical response and specificity of the functionalized NPs towards avidin was evaluated by optical measurements. In the third chapter three strategies were explored for the preparation of the shell@core nanostructures using polymers synthesized via RAFT polymerization. First, hydrophilic monomers (poly(ethylene glycol) methyl ether acrylate (PEGA) and acrylic acid (AA)) were polymerized in solution via RAFT polymerization, yielding polymers containing the RAFT agent thus named macroRAFT (MR) agents. Then a second block was synthesized from the MR agent via RAFT emulsion polymerization of the hydrophobic monomers methyl methacrylate (MMA) and butyl acrylate (BA), yielding a block copolymer. This block copolymer was used in the two first strategies: for the preparation of the Au nanostructures. In the case of the post-modification strategy, previously prepared Au NPs were mixed with the copolymer, and in the case of in situ strategy Au NPs were generated in the presence of the block copolymer. In the third strategy, the second block (hydrophobic block) was grown from the MR agent previously adsorbed on the Au NPs surface (MR@Au NPs). In this last strategy, some parameters that allow obtaining copolymer@Au nanostructures were identified and optimized, such as the controlled addition of the hydrophobic monomers as well as the concentration of MR. In the fourth chapter, the most promising type of copolymer@Au nanostructures obtained in the previous chapter was selected to be functionalized and used in biosensing tests. Copolymer@Au nanostrucures were functionalized with biotin using the click chemistry reaction and the optical response and specificity of the functionalized NPs towards avidin was evaluated by optical measurements. In order to get a better understanding of the interactions between the copolymer (functionalized, or not with biotin) and the bioanalyte at molecular level, preliminary studies have been carried out at the air-water interface using the Langmuir-Blodgett technique. Additionally, fluorescent-copolymer@Au nanostructures were also prepared via RAFT polymerization of a fluorescent monomer (monomer modified with FITC) from MR@Au NPs and subsequent polymerization of MMA:BA monomers in order to assess the effect of the distance between the core and the fluorophore on the optical response of this type of nanostructures. The different strategies developed during this thesis to prepare gold nanostructures allowed to establish solutions for different critical aspects such as robustness, control of morphology and colloidal stability of polymer@Au nanostructures for applications in biodetection as well as procedures for functionalization. The use of the RAFT mechanism, in particular the grafting from strategy, proved very promising for the encapsulation and (multi)functionalization of AuNPs and can potentially be extended to other types of nanomaterials.