Validation of a novel human milk oligosaccharide for use in infant formula using gastrointestinal in vitro technologies

Abstract

O corpo humano abriga uma comunidade microbiana da qual, parte vive no aparelho digestivo. O cólon é a região com a comunidade bacteriana mais densa, denominada microbiota intestinal. O seu desenvolvimento em bebés pode ser influenciado por um número de fatores, tal como o ambiente intrauterino, tipo de parto e/ou o modo de alimentação. No que diz respeito ao modo de alimentação, o leite materno tem um papel importante na colonização intestinal de bebés através do fornecimento de uma variedade de oligossacáridos. Para bebés que não possam ser amamentados, uma formulação infantil é necessária como substituta e, portanto, deve satisfazer as necessidades nutritivas dos recém-nascidos. A manipulação da microbiota intestinal, recorrendo à adição de probióticos e/ou prebióticos à dieta, tem-se tornado uma prática recorrente. Assim, este estudo teve como objetivo testar um novo oligossacárido do leite humano (NMO), via experiências gastrointestinais in vitro, a fim de proporcionar a melhor formulação possível para substituição do leite humano. Inicialmente, uma experiência de pré-triagem foi realizada para obter informações sobre as potenciais diferenças inter-individuais entre bebés, em resposta à administração de NMO. No global, 7 dos 10 dadores responderam intensamente ao tratamento com NMO, o que resultou numa acidificação do meio. Um efeito bifidogénico foi também observado, com a degradação de NMO ocorrendo através de diferentes cenários de resposta. A escolha do dador 10 foi fundamentada tendo em conta a sua elevada taxa de fermentação e consequente produção de acetato, mas principalmente devido a um intenso efeito bifidogénico, mais especificamente, a um estímulo característico da B. longum subsp. infantis, após administração de NMO. De seguida, um baby M-SHIME® com 5 unidades foi realizado utilizando amostras fecais de um único doador (bebé 10) como inóculo, tornando esta segunda parte do projeto ainda exploratória. Diferentes doses de um "golden standard" (GS) e NMO foram testados. O consumo base-ácido, as concentrações de ácidos gordos de cadeia curta (AGCCs), lactato e amónio e a composição da microbiota foram analisados. Durante o período de tratamento, 3.2 g/L de GS, NMO, ou combinações destes, foram adicionados aos reatores, resultando no aumento dos níveis de consumo de base-ácido e de AGCCs relacionados com a saúde. Um pico no lactato foi observado para as misturas e diminuições dos níveis de marcadores proteolíticos foram também observados. No que diz respeito a mudanças na composição de Bifidobacterium, GS provocou um estímulo de B. longum, enquanto NMO aumentou a abundância de B. longum subsp. infantis, com um efeito dose-resposta claro em ambas as situações. No decorrer do tempo, a administração NMO causou também um aumento dos níveis de Enterobacteriaceae com relação dose-resposta. Das enterobactérias podem também fazer parte alguns agentes patogénicos e, sendo assim, a dosagem de NMO seria recomendada. A dose ótima pode, por conseguinte, ser a dose para a qual existe ainda uma forte estimulação de B. longum subsp. infantis e AGCCs relacionados com a saúde, embora não resultando numa grande expansão de enterobactérias, como, por exemplo, 75% / 25% ou 50% / 50% (GS / NMO).

The human body harbours a microbial community, part of which lives in the gastrointestinal tract. The colon is the region with the densest bacterial community, called gut microbiota. Its development in infants may be influenced by a number of factors, like intra-uterine environment, delivery mode and/or the feeding mode. Regarding the feeding mode, human breast milk plays an important role in early gut colonization of infants. It does so by providing a variety of human milk oligosaccharides. For infants who cannot be breastfed, infant formula is required as a substitute and so, must satisfy the nutritional requirements of infants. Since modulation of gut microbiota resorting to the addition of probiotics and/or prebiotics to the diet is increasingly becoming a recurrent practice, in order to provide infants that do not receive breast-feeding with the best possible alternative formula feeding, this study aimed to test a new human milk oligosaccharide (NMO) via gastrointestinal in vitro experiments. Firstly, a pre-screening experiment was performed to gain information on the potential inter-individual differences among babies in response to NMO administration. Overall, 7 out of the 10 donors responded strongly to the NMO treatment resulting in an acidification of the medium. A bifidogenic effect was also noted, with NMO degradation being found to occur via several different response scenarios. The choice of donor 10 was substantiated based on the strong overall fermentation and corresponding acetate production, but mainly due to a strong bifidogenic effect and thus, most interestingly, a specific stimulation of B. longum subsp. infantis upon NMO administration. Afterwards, a 5 units’ baby M-SHIME® experiment was performed using faecal sample from a single donor (donor 10) as the inoculum, making this second part of the research still exploratory. Different doses of a “golden standard” (GS) and NMO were tested. Base-acid consumption, short chain fatty acids (SCFAs), lactate, ammonium concentrations and microbiota composition were analysed. For the treatment period, 3.2 g/L of GS, NMO or combinations of thereof were supplemented to the vessels resulting in increased base-acid consumption and health-related SCFAs levels. A peak in lactate was observed for the mixtures and minor decreases were also observed on proteolytic markers. With respect to changes in Bifidobacterium composition, it followed that GS stimulated B. longum, while NMO increased the abundance of B. longum subsp. infantis with a clear dose-response effect in both situations. Over time, NMO administration caused an increase of Enterobacteria levels in a dose-related way. Given the fact that Enterobacteria also contain opportunistic pathogens, dosing would be recommended. The optimal NMO dose might therefore be the dose at which there is still a strong stimulation of B. longum ssp. infantis, and health-related SCFAs, although not resulting in a major expansion of Enterobacteria, like for example 75% / 25% or 50% / 50% (GS / NMO).