Photodynamic therapy in the control of Pseudomonas syringae pv. actinidiae in kiwi plants

Abstract

O kiwi é o fruto produzido pela Actinidia deliciosa e é mundialmente consumido e comercializado. O cultivo deste fruto, tem vindo a ser extremamente afetado pela Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), uma bactéria fitopatogénica cada vez mais dispersa. Deste modo, pode originar grandes perdas económicas, afetando gravemente o comércio de kiwi em alguns países, incluindo Portugal, que tem vindo a aumentar significativamente a sua produção e a afirmar-se no comércio internacional. Os tratamentos disponíveis para esta doença ainda são escassos, sendo a pulverização dos pomares com compostos de cobre o mais usado, nomeadamente o óxido cuproso (Cu2O). Contudo, estes compostos devem ser evitados devido à sua elevada toxicidade e, por isso, é essencial a procura de novas formas de controlo da Psa que assegurem também a integridade das plantas. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode ser uma abordagem alternativa para inativar a Psa. A aPDT consiste no uso de um fotossensibilizador (PS) que absorve radiação e transmite a energia ou eletrões adquiridos a moléculas de oxigénio, formando espécies de oxigénio altamente reativas que afetam diferentes alvos moleculares, o que torna muito improvável o desenvolvimento de resistência nos microrganismos. É ainda de salientar, que atualmente, a aplicação da aPDT não foi testada no controlo da Psa em plantações de kiwi. Assim, o objetivo deste trabalho consistiu em avaliar a eficácia da aPDT para inativar ou reduzir a Psa, usando a porfirina Tetra-Py+-Me como PS e diferentes intensidades de radiação, nomeadamente 40 W m-2, 150 W m-2 e luz solar (por ser adequada para usar nas plantações). Inicialmente foi analizado o grau de inativação da Psa in vitro com 5μM de Tetra-Py+-Me sob baixa radiação (40 W m-2). Depois, os ensaios ex vivo usando folhas de kiwi artificialmente contaminadas, foram feitos com o PS a uma concentração dez vezes maior (50μM) sob 150 W m-2 e irradiação solar. Nos ensaios in vitro foi observada uma redução de 6 logs após 90 min de irradiação. Nos ensaios ex vivo o decréscimo foi menor, redução de aproximadamente 1,8 log a 150 W m-2, 1,2 log a 40 W m-2 e 1,5 log sob a radiação solar. Não foram observados efeitos negativos nas folhas após o tratamento. O óxido cuproso foi testado in vitro à concentração recomendada na legislação portuguesa (50 g hL-1) e em concentrações 10 vezes mais baixas, que inativam a Psa de forma eficaz após cinco minutos de tratamento. No geral, demonstrou-se que aPDT in vitro e ex vivo, usando um derivado de porfirina sob radiação solar natural, é um método eficaz para inativar a Psa, sendo que não danifica a planta e pode ser aplicada por pulverização. A fim de explorar o potencial real da aPDT como uma alternativa ao uso intensivo de tratamentos convencionais, são necessários mais estudos para determinar a eficácia da aPDT em condições de campo e também para avaliar o impacto ambiental desta nova abordagem. Também foi demonstrado que a concentração de cobre atualmente recomendada para tratar a Psa pode ser significativamente reduzida. Outros estudos ex vivo e in vivo são, contudo, necessários.

Kiwifruit is produced by Actinidia deliciosa and is consumed and marketed worldwide. The cultivation of this fruit has been greatly affected by Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), a phytopathogenic bacterium that is increasingly dispersed. This can lead to severe economic losses, seriously affecting kiwifruit trade in some countries, including Portugal, which has significantly increased its production and established itself in international trade. The available treatments for this disease are still scarce and spraying the orchards with copper compounds is the most used, in particular cuprous oxide (Cu2O). However, these compounds should be avoided due to their high toxicity and, therefore, it is essential to search for new ways of controlling Psa which also ensure the integrity of the plants. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) can be an alternative approach to inactivate Psa. aPDT consists in the use of a photosensitiser (PS) which absorbs radiation and transmits the acquired energy or electrons to oxygen molecules to form highly reactive oxygen species that affect different molecular targets which makes it very unlikely that the microbes can develop resistance. It should also be noted that, currently, the application of aPDT has not been tested for the control of Psa in kiwi plantations. Thus, the objective of this work was to evaluate the effectiveness of aPDT to inactivate or reduce Psa, using the porphyrin Tetra-Py+-Me as a PS and different radiation intensities, namely 40 W m-2, 150 W m-2 and sunlight (because it is suitable for use in plantations). Initially, the degree of inactivation of Psa in vitro with 5 μM Tetra-Py+-Me under low radiation (40 W m-2) was tested. After, ex vivo experiments usingartificially contaminated kiwi leaves, were done with PS concentration ten times higher (50 μM) under 150 W m-2 and sunlight irradiation. In the in vitro assays, a reduction of 6 logs was observed after 90 min of irradiation. In the ex vivo tests, the decrease was lower, approximately 1.8 log reduction at 150 W m-2, 1.2 log at 40 W m-2 and 1.5 log under solar radiation. No negative effects were observed on leaves after treatment. Cuprous oxide tested in vitro at the recommended concentration in Portuguese legislation (50 g hL-1) and at 10 times lower concentrations, efficiently inactivated Psa (5 log inactivation) after a few minutes of treatment. Overall it was demonstrated that in vitro and ex vivo aPDT with a porphyrin derivative under natural solar radiation is effective to inactivate Psa, does not damage the plant and can be applied by spraying. In order to explore the real potential of aPDT as an alternative to the intensive use of conventional treatments, further studies are necessary to determine the effectiveness of aPDT in field conditions and also to evaluate environmental impact of this new approach. It was also showed that copper concentration currently advised to treat Psa can be greatly reduced. Further ex vivo and in vivo studies are, however, required.