Inativação fotodinâmica de bactérias e fungos com fotossensibilizadores naturais e sintéticos

Abstract

A inativaçãoo fotodinâmica de microrganismos (PDI) baseia-se na combinação de três elementos não tóxicos: uma molécula fotossensibilizadora (PS), luz e oxigénio. O PS, quando excitado pela luz na presença de oxigénio, leva a geração de espécies reativas de oxigénio tóxicas para as células, que causam danos celulares irreversíveis e letais. Esta abordagem tem sido considerada como uma alternativa promissora a outros métodos de inativação de microrganismos. No entanto, o alargamento da sua aplicação, e ainda limitado pela baixa suscetibilidade dos microrganismos quando organizados em biofilmes, pela redução da e ciência dos PS quando incorporados em formulações para aplicação direta e pela disponibilidade de PS não tóxicos compatíveis com matrizes alimentares. Para este trabalho foram definidos os seguintes objetivos especficos: (a) avaliar a e ciência de curcumina na inativação de biofilmes de microrganismos relevantes como patogénicos alimentares; (b) avaliar a e ciência de PS naturais e sintéticos na inativação de fungos topatogénicos ou agentes de deterioração de frutos; (c) avaliar o efeito da incorporação de PS de referência (porfirina catiónica) em géis e cremes para aplicação superficial. Assim o fotossensibilizador natural curcumina não causou inativação significativa (0; 6 Log) em biofilmes de Staphylococcus aureus. No entanto, a curcumina a 200 M conduz uma redução significativa (3; 4 Log), na concentração de células viáveis em biofilmes de L. innocua, após irradiação com luz azul (270 J:cm􀀀2). Os biofilmes de L. innocua, usada como modelo do patogénico alimentar L. monocytogenes revelaram maior suscetibilidade a inativação fotodinâmica com curcumina. Pelo contrário, o crescimento dos fungos Lasiodiploidia theobromae e Botrytis cinerea, usados como modelo de fungos patogénicos da vinha e agentes de deterioração de frutos, não foi signi cativamente atenuado na presença de curcumina e ribo avina, com exposição á luz solar. A por firina tetracatiónica Tetra-Py+-Me e o corante azul de toluidina causaram atraso e atenuação no crescimento do micélio de ambos os fungos, sendo a por rina mais e caz do que o corante. O efeito fotossensibilizador foi maior em L. theobromae já que a estirpe de B. cinerea usada neste trabalho sofreu atenuação do crescimento por acção direta da luz solar, mesmo na ausência de PS. A incorporação de uma por rina catiónica em formulações para aplicação tópica (cremes) atenuou signi cativamente a sua efi ciência na inativação de células livres, relativamente á efi ciência de inativação do mesmo PS em solução aquosa. No entanto, conseguiuse inativação completa de suspensões de Staphylococcus aureus (MSSA e MRSA) com um creme contendo 50 M desta por rina catiónica e irradiação com luz branca (540 J:cm􀀀2). A curcumina revela elevado potencial como fotossensibilizador compatctível com alimentos, podendo ser aplicado no controle de Listeria em alimentos e superfícies de contacto com alimentos. No entanto, não se revelou e caz no controle do crescimento de fungos associados à biodeterioração de frutos. Os resultados obtidos com fotossensibilizadores sintéticos, nomeadamente da família das por rinas, permitem perspetivar uma alternativa de baixa toxicidade ambiental a outros antifúngicos de uso agrícola, com possível aplicação no tratamento de doenças do tronco da videira e de outras árvores de fruto. A incorporação de PS em formulações adequadas à forma de aplicação, nomeadamente cremes para aplicação tópica, tem impacto negativo na e ficiência de inativação que pode, no entanto, ser compensado aumentando a concentração de PS e a dose de energia aplicada.

The photodynamic inactivation of microorganisms (PDI) is based on the combination of three non-toxic elements: a photosensitizer (PS), light and oxygen. When the PS is excited by light, in the presence of oxygen, cytotoxic reactive oxygen species are formed, leading to irreversible damage and cell death. This approach has been regarded as a promising alternative to other methods of inactivation of microorganisms. However, the expansion of its application to contexts in which microbial inactivation is intended, is still limited by the low susceptibility of microbial bio lms, by the availability of non-toxic food-grade PS and also by the attenuation of the photosensitization e ciency of PS when incorporated in formulations for topic application. This work aimed at the following objectives: (a) to evaluate the e ciency of curcumin for the inactivation of bio lms of relevant bacterial food pathogens; (b) to evaluate the e ciency of natural and synthetic PS on the inactivation of phytopathogenic fungi or fungal agents of fruit deterioration; (c) to evaluate the e ect of incorporation of PS (cationic porphyrin) in gels and creams for topic application. The natural photosensitizer curcumin failed to signi cantly inactivate (0:6 Log) bio lms of Staphylococcus aureus. However, 200 μM of curcumin caused a reduction of approximately (3; 4 Log) log in the concentration of viable cells in bio lms of Listeria innocua, upon irradiation with blue light (270 J:cm􀀀2). The bio lms of L. innocua, used as a model of food pathogen L. monocytogenes showed greater susceptibility to photodynamic inactivation with curcumin than with a cationic porphyrin used as reference PS. On the contrary, the growth of the fungi Botrytis cinerea and Lasiodiplodia theobromae, used as models of vine pathogens and fruit decay agents, was not signi cantly attenuated in the presence of curcumin and ribo avin, upon exposure to sunlight. The tetracationic porphyrin Tetra-Py+-Me and toluidine blue O caused delay and attenuation of mycelium growth in both fungi, being the porphyrin more e ective than the dye. The photosensitizing e ect was more obvious in L. theobromae as the B. cinerea strain used in this study su ered growth attenuation by direct action of sunlight, even in the absence of PS. The incorporation of a cationic porphyrin in topical formulations (creams) signi cantly reduce the e ciency of inactivation of planktonic cells and bacterial bio lms, when compared to the e ect of aqueous solutions of the free PS. However, complete inactivation of Staphylococcus aureus (MSSA and MRSA) was achieved with a cream containing 50 M of a cationic porphyrin (Tetra-Py+ 􀀀Me)andirradiationwithwhitelight(540 J.cm􀀀2). Curcumin shows high potential as a food-grade photosensitizer and may be applied in the control of Listeria in food products and food contacting surfaces. However, it has not proven e ective in controlling the proliferation of fungi associated with the biodeterioration of fruits. The results obtained with a synthetic photosensitizer (cationic porphyrin) may, however, be regarded as a promising low-toxicity alternative to current antifungals used in agriculture. The incorporation of a PS in appropriate formulations, namely creams for topical application, has a negative impact on the e ciency of inactivation that can be compensated by increasing the concentration of PS and the dose of applied energy.