Cytoskeleton regulation in bladder cancer cells after photodynamic treatment

Abstract

A terapia fotodinâmica (PDT) é uma modalidade promissora para o tratamento do cancro. Esta terapia baseia-se na interação entre um composto químico (fotossensibilizador, PS), luz com um determinado comprimento de onda e oxigénio molecular para originar a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). Devido à sua elevada reatividade, estas espécies tóxicas podem causar danos severos conduzindo à morte celular. Atualmente, os PS disponíveis na clínica para o tratamento de tumores apresentam baixa seletividade para as células tumorais. Estudos anteriores do nosso grupo descreveram uma porfirina conjugada com unidades dendríticas de galactose (PorGal8) como um novo PS solúvel em solução aquosa, capaz de gerar ROS após fotoativação e com reconhecimento por parte de proteínas (galectina-1) que se encontram sobreexpressas nas células do cancro da bexiga. Vários estudos têm descrito alterações no citoesqueleto em resposta ao tratamento fotodinâmico. No entanto, a contribuição da desorganização do citoesqueleto na morte celular induzida por PDT encontra-se pouco esclarecida. Neste trabalho, avaliámos de que forma alterações nos constituintes do citoesqueleto – filamentos de actina, filamentos intermédios e microtúbulos – estão relacionadas com morte celular induzida por PDT com PorGal8. O uptake de PorGal8 em duas linhas celulares do cancro da bexiga derivadas de carcinoma de células transicionais (UM-UC-3 e HT-1376), foi dependente da concentração. O uptake celular de PorGal8 foi superior nas células UM-UC-3, que exibem níveis superiores da proteína galectina-1, comparativamente com as células HT-1376. PorGal8 mostrou não ser tóxico no escuro. A fotoativação da PorGal8 resultou numa fototoxicidade significativamente superior nas células UM-UC-3 relativamente às células HT-1376. A PorGal8 não induziu alterações significativas nos níveis de proteína α-tubulina nas células UM-UC-3. No entanto, observou-se uma redução significativa nos níveis de α-tubulina nas células HT-1376 vinte e quatro horas após tratamento com irradiação. Apesar de se ter observado uma recuperação na organização dos microtúbulos em algumas células, a intensidade da fluorescência diminuiu consideravelmente na maior parte das células HT-1376. Uma redução significativa nos níveis de proteína dos filamentos intermédios (vimentina) foi observada em ambas as linhas celulares vinte e quatro horas após irradiação. Trinta minutos após a irradiação, as células UM-UC-3 e HT-1376 apresentaram uma clara retração nos filamentos de actina com perda de fibras de stress. Ao contrário das células UM-UC-3 em que não se verificaram sinais de recuperação, em algumas células HT-1376 verificou-se uma certa reorganização dos filamentos de actina, com curtas fibras de stress, longas extensões, grandes filopodia, o que parece sugerir uma possível recuperação das células HT-1376. A RhoA, uma proteína da família de pequenas proteínas GTPases, descrita como estando relacionada com a expressão da galectina-1, foi adicionalmente avaliada. Resultados preliminares indicaram que a PorGal8 induziu uma tendência para aumentar os níveis de RhoA nas células HT-1376 vinte e quatro horas após tratamento com irradiação. Concluindo, os nossos resultados contribuem para o esclarecimento dos mecanismos subjacentes dos efeitos fototóxicos da PorGal8. Uma melhor compreensão dos intervenientes e das alterações induzidas imediatamente após PDT nas estruturas do citoesqueleto em cancros resistentes à terapia, poderão contribuir para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos adjuvantes à PDT.

Photodynamic therapy (PDT) is a promising modality for the treatment of cancer that involves light of an appropriate wavelength and a photosensitizing drug (photosensitizer, PS), used in conjunction with molecular oxygen, leading to the production of reactive oxygen species (ROS). In a biological environment, these toxic species can interact with the cellular constituents eliciting cell death. Currently, the PS available show poor tumor specificity. Previous work from our research group reported a porphyrin conjugated with dendritic units of galactose (PorGal8) as a new water soluble PS, able to generate ROS after photoactivation and exhibiting increased selectivity to bladder cancer cells overexpressing galectin-1. Several studies reported cytoskeleton alterations derived from photodynamic treatments. However, the role of cytoskeleton disorganization in cell death induced by PDT remains unclear. In this work we evaluated whether changes in the cytoskeletal constituents - actin filaments, intermediate filaments and microtubules - are correlated with cell death triggered by PDT with PorGal8. The uptake of PorGal8 in two bladder cancer lines derived from transitional cell carcinoma (UM-UC-3 and HT-1376 cells), was concentration dependent. Cellular uptake of PorGal8 was higher in UM-UC-3 cells that express higher levels of galectin-1 protein than HT-1376 cells. PorGal8 was nontoxic in dark. Photoactivation of PorGal8 resulted in a significantly higher phototoxicity in UM-UC-3 cells than HT-1376 cells. PorGal8 did not change the α-tubulin protein levels in UM-UC-3 cells but reduced α-tubulin twenty-four hours after photodynamic activation in HT-1376 cells. Although a few cells showed a recovery in microtubules organization, the fluorescence intensity decreased noticeably in most of the HT-1376 cells. A significant decrease in intermediate filaments (vimentin) protein levels was exhibited in both cell lines twenty-hours after irradiation. Thirty minutes post-irradiation, UM-UC-3 and HT-1376 cells showed a clear retraction of actin filaments with loss of stress fibers. Although no recovery was observed in UM-UC-3 cells, some cells present some reorganization in actin filaments, presenting short stress fibers, long extensions, like large filopodia, suggesting a possible recovery in HT-1376 cells. A small GTPases family protein, RhoA, referred to be involved with galectin-1 expression, was also evaluated, with preliminary results indicating a tendency towards an increase in HT-1376 cells twenty-four hours after therapy. Overall, our results give new insights into the mechanisms underlying the phototoxic effects of PorGal8. Better understanding the intrinsic web of events and alterations on cytoskeleton structures induced immediately after photodynamic treatment in resistant cancers may contribute to envisage new potential therapeutic adjuvants for PDT.