Porphyrin derivatives and mRNA alternative splicing induced by photodynamic therapy

Abstract

Neste trabalho é descrita a síntese de porfirinas regulares e N-confusas com o objetivo da realização de estudos acerca da sua eficiência como fotossensibilizadores (PSs) em terapia fotodinâmica (PDT) e a influência desta no splicing alternativo do mRNA. Os derivados porfirinicos foram preparados tendo como estrutura base a 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina. Inicialmente irá ser realizada uma breve introdução sobre os macrociclos tetrapirrólicos, nomeadamente sobre porfirinas. Segue-se o capítulo 2 onde há a descrição sintética dos derivados porfirínicos usados neste trabalho. Desta forma, através das condições estabelecidas por Lindsey foram sintetizadas duas porfirinas: 5,10,15,20-tetraquis(4-bromometilfenil)-2-aza-21-carboporfirina e a 5,10,15,20-tetraquis(4-bromometilfenil)porfirina e procedendo-se à sua cationização com piridina que originou os derivados 5,10,15,20-tetraquis(4-(piridinio-1-il-metil)fenil)-2-aza-21-carboporfirina e 5,10,15,20-tetraquis(4-(piridinio-1-il-metil)fenil)porfirina. A formação das porfirinas neutras ocorreu com baixo rendimento, mas a sua cationização foi conseguida com rendimentos acima dos 80%. Neste mesmo capítulo ainda são apresentadas as caracterizações fotofísicas de todos os derivados porfirínicos, nomeadamente fluorescência e geração de oxigénio singleto. As porfirinas regulares foram aquelas que demonstraram bons rendimentos quânticos de fluorescência e capacidade para gerar oxigénio singleto em DMF. No capítulo 3 são descritos todos os estudos biológicos realizados neste trabalho. Inicialmente foram realizados estudos de viabilidade celular em células MCF-7 e HeLa usando o teste com WST-1 e ATPliteTM e como PS de referência a 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina. Foram realizados estudos de concentração (0.1 μM-5.0 μM) e tempo de irradiação (0, 5, 10 e 15 min). A 5,10,15,20-tetraquis(4-(piridinio-1-il-metil)fenil)porfirina revelou ser o melhor PS, tendo sido selecionado um tempo de irradiação de 15 min e uma concentração até 5 μM para o estudos subsequentes. Os estudos de localização subcelular e uptake revelaram que a 5,10,15,20-tetraquis(4-(piridinio-1-il-metil)fenil)porfirina entra nas células mas não se localiza no núcleo como acontece com o controlo positivo. São ainda descritos estudos acerca do tipo de morte celular que as células podem sofrer depois da PDT com estes PSs. Por fim os estudos da influência da terapia fotodinâmica no splicing alternativo mostrou que a 5,10,15,20-tetraquis(4-(piridinio-1-il-metil)fenil)porfirina e a 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina parecem induzir um ligeiro splicing alternativo do mRNA.

In this work the synthesis of regular and N- confused porphyrins with the objective of assessing its efficiency as photosensitizers (PSs) in photodynamic therapy (PDT) and its influence in alternative splicing of mRNA is described. The porphyrin derivatives were prepared having as a template the 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridynium-4-yl)porphyrin. Initially, a brief introduction about tetrapyrrolic macrocycles, namely about porphyrins will be done. Then, chapter 2 will follow with the synthetic description of the porphyrin derivatives used in this work. Through Lindsey conditions, two porphyrins were synthesized: 5,10,15,20-tetrakis(4-bromomethylphenyl)-2-aza-21-carbaporphyrin; 5,10,15,20-tetrakis(4-bromomethylphenyl)porphyrin and then we proceeded to their cationization with pyridine to give: 5,10,15,20-tetrakis(4-(pyridynium-1-yl-methyl)phenyl)-2-aza-21-carbaporphyrin and 5,10,15,20-tetrakis(4-(pyridynium-1-yl-methyl)phenyl)porphyrin. The formation of the neutral porphyrins occurred with low yield but its cationization was achieved with yields higher than 80%. In the same chapter, the photophysical characterization of all porphyrins, namely singlet oxygen production and fluorescence quantum yield were described. The regular porphyrins demonstrated good fluorescence quantum yields and ability to generate singlet oxygen in DMF. In chapter 3, all the biological assays done in this work are described. Initially, cellular viability studies were done in MCF-7 and HeLa cells using the WST-1 reagent and ATPliteTM and as PSs reference the 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridynium-4-yl)porphyrin. Studies of concentration (0.1 μM-5.0 μM) and irradiation time (0, 5, 10 and 15 min) were also done. The 5,10,15,20-tetrakis(4-(pyridynium-1-yl-methyl)phenyl)porphyrin showed to be the best PS and 15 min irradiation and a concentration up to 5 μM for the following studies were selected. The subcellular localization and uptake studies revealed that 5,10,15,20-tetrakis(4-(pyridynium-1-yl-methyl)phenyl)porphyrin can enter the cells but it is not localized in the nucleus, contrary to 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridynium-4-yl)porphyrin. The studies regarding type of cell death that cells undergo after PDT treatment were also assessed. At last, the 5,10,15,20-tetrakis(4-(pyridynium-1-yl-methyl)phenyl)porphyrin and 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridynium-4-yl)porphyrin seemed to induce a small alternative splicing of mRNA.