Phage therapy: a new technology for depuration of bivalves

Abstract

De forma a reduzir a transmissão de agentes patogénicos através do consumo de bivalves, devem ser desenvolvidas novas tecnologias a associar à depuração, tal como a terapia fágica. A eficácia da utilização de fagos para controlar infeções bacterianas tem sido relatada em diversos estudos. No entanto, relativamente à utilização da terapia fágica para inativar bactérias patogénicas durante a depuração de bivalves, existe apenas um estudo preliminar, feito sem circulação de água (contrariamente ao que acontece na depuração industrial). O sucesso da combinação destas duas tecnologias depende da compreensão detalhada da dinâmica sazonal e espacial da comunidade bacteriana total, incluindo bactérias associadas a doenças devido ao consumo de bivalves e indicadores de qualidade microbiológica da água, nas zonas de produção de bivalves. Durante o Verão, a comunidade bacteriana total apresentou uma maior complexidade e aumento da abundância dos principais grupos de bactérias patogénicas, indicando que deste pode ser um período crítico onde a terapia fágica deve ser aplicada. No entanto, devido ao impacto das fontes de poluição antropogénicas e outras fontes de contaminação, a terapia fágica poderá ter que ser aplicada também durante a estação fria. Cinco novos fagos foram isolados e caracterizados para controlar Salmonella Typhimurium (phSE-1, phSE-2 e phSE-5) e Escherichia coli (phT4A e EC2A), a fim de avaliar a sua potencial aplicação durante a depuração de bivalves. Os ensaios in vitro demonstraram que o uso de fagos individuais (phT4A e EC2A), pode ser uma alternativa eficaz para o controlo de E. coli, em particular, quando combinados em cocktail. A depuração num sistema estático com MOI 1 usando os fagos phT4A e EC2A, foi a condição em que se obteve melhores resultados (diminuição ~2.0 log CFU/g) em berbigões artificialmente contaminados. Quando berbigões naturalmente contaminados foram tratados em sistema estático com as suspensões de fagos individuais e cocktails de fagos, foram obtidas reduções semelhantes na concentração de E. coli (diminuição ~0.7 log UFC/g). Quando os berbigões naturalmente contaminados foram depurados com o fago phT4A com circulação de água, a concentração de bactéria foi reduzida mais rapidamente que na ausência de fagos. Os resultados dos ensaios in vitro mostraram igualmente que o controlo de S. Typhimurium com fagos phSE-5 e phSE-2 e o cocktail destes dois fagos foi eficiente. A aplicação do fago phSE-5 e cocktail (phSE-2/phSE-5) inativou eficazmente S. Typhimurium em berbigões contaminados artificialmente (redução de 1.7 UFC/g com o fago phSE-5 e 0.7 log UFC/g com o cocktail phSE-2/phSE-5) e em berbigões naturalmente contaminados (redução de 0.9 log UFC/g para ambos para a suspensão simples e para o cocktail) durante a depuração em sistema estático, especialmente quando são usadas suspensões do fago phSE-5 a uma MOI baixa. Os berbigões artificialmente contaminados também foram mais eficazmente descontaminados durante a depuração com circulação de água na presença do fago phSE-5 que quando foi usada apenas depuração sem adição de fagos (i.e. o processo convencional de depuração). Este é o primeiro trabalho em que foi testado o uso de fagos durante a depuração de berbigões naturalmente contaminados e contaminados artificialmente em sistemas com circulação de água, tal como acontece na depuração industrial de bivalves, provando assim que esta tecnologia poderá ser transposta para a indústria. Os resultados obtidos usando fagos de E. coli e de S. Typhimurium mostraram que a combinação da terapia fágica e depuração melhora a segurança microbiana dos bivalves para consumo humano, melhorando a eficiência de descontaminação. Além disso, esta abordagem também permite reduzir o tempo necessário para a depuração e consequentemente, os custos a ela associados. No entanto, a seleção e caracterização dos fagos e determinação da MOI mais adequado para ser utilizado durante a terapia fágica, é essencial para o sucesso da terapia fágica no controlo de bactérias patogénicas.

In order to reduce the infections by microbial pathogens through the consumption of bivalves, it is essential to develop alternative approaches to the conventional depuration practices. One new promising approaches is to combine the depuration of bivalves with phage therapy. The use of phages to control bacterial infections has been reported across numerous fields by many researchers. However, relatively the combination of depuration and phage therapy to eliminate pathogenic bacteria in bivalves there is only one study, and this study did not replicate industrial depuration procedures. The successful combination of those two technologies depends on a detailed understanding of the seasonal and spatial dynamics of the overall bacterial communities, including the bacteria implicated in bivalves-related illness and the indicators of microbiological water quality, in the harvesting areas. During the summer, the total bacterial community presented high complexity and an increase of abundance of the main pathogenic bacteria, indicating that this season is the critical time frame when phage therapy should be applied. However, due to the impact anthropogenic and other sources of contamination, phage therapy could be necessary also during the cold season. Five new phages were isolated and characterized to control Escherichia coli (phT4A and ECA2) and Salmonella Typhimurium (phSE-1, phSE-2 and phSE- 5) in order to evaluate their potential application during depuration. The in vitro assays indicated that the use of phages individually (phT4A and EC2A) or combined in cocktails (phT4A/EC2A), can be an effective alternative to control of E. coli, particularly if combined in a phage cocktail. Depuration in static seawater at MOI 1 with phage phT4A and ECA2 revealed to be the best condition (decreased of the 2.0 log CFU/g) in artificially contaminated cockles. When naturally contaminated cockles were treated in static seawater with single phage suspensions and the phage cocktail, similar decreases in the concentration of E. coli (decreased of the 0.7 log CFU/g) were achieved. When naturally contaminated cockles were depurated using conventional practices with phage phT4A, bacterial concentration was reduced sooner. The assays in vitro, demonstrated that the control S. Typhimurium with phages phSE-5 and phSE-2 and with these two phages combined in a cocktail was efficient, paving way for the in vivo studies. The efficiency of bacterial inactivation with single phage suspensions of phSE-5 and phSE-2 leaded to further in vivo studies to control of Salmonella in bivalves. The application of phage phSE-5 and phage cocktail phSE-2/phSE-5 can be successfully employed to inactivate S. Typhimurium (reduction of 1.7 log CFU/g for phSE-5 and 0.7 log CFU/g for phSE-2/phSE-5 in artificially contaminated cockles and reduction of 0.9 log CFU/g for both in naturally contaminated cockles) during depuration in static system, especially if phSE-5 phage is used individually and if a low MOI is employed. Using conventional depuration practices in the presence of phage phSE-5, bacterial concentration is more quickly and efficiently reduced in artificially contaminated cockles. To our knowledge, this is the first report of a depuration trial using phages in the artificially and naturally contaminated cockles using industrial depuration procedures, proving that this technology can be ported into the bivalves industry. The obtained results using phages of E. coli and S. Typhimurium indicated that combining phage therapy with depuration procedures enhance bivalve microbial safety for human consumption by improving decontamination efficiency. Moreover, this approach also displays the advantage of reducing the time required for depuration and consequently its associated costs. However, the selection and characterization of appropriate phages and the most adequate multiplicity of infection to be used in phage therapy is a critical stage to achieve a successful phage-mediated control of pathogenic bacteria.