Do silver nanoparticles induce cytotoxicity and genotoxicity to skin, liver and blood cell lines?

Abstract

As nanopartículas de prata (AgNPs) estão entre as nanopartículas mais utilizadas devido às suas propriedades fisico-químicas e biológicas (como por exemplo a sua eficiente actividade antimicrobiana). Contudo, existe uma crescente preocupação relativamente ao seu potencial impacto no ambiente e na saúde humana. Mais especificamente, ainda não está explicada a influência dos revestimentos das nanopartículas na citotoxicidade, inflamação e potencial genotóxico em células humanas. Neste estudo, as AgNPs revestidas com citrato ou poli(etilenoglicol) (PEG) foram utilizadas para determinar in vitro a influência do revestimento nos perfis de toxicidade das AgNPs em células da pele, fígado e sangue. A linha celular de queratinócitos humanos (HaCaT) foi exposta a AgNPs de 30 nm revestidas com citrato ou PEG (Cit30 ou PEG30) onde foram determinados a viabilidade, stress oxidativo, produção de citoquinas, apoptose e efeito citostático. No geral, as Cit30 foram mais citotóxicas do que as PEG30 demonstrando a influência do revestimento relativamente ao modo da morte celular e à progressão do ciclo celular para as concentrações testadas (IC50 e IC20 para as Cit30, correspondendo a 40 μg/mL e 10 μg/mL, respectivamente). Enquanto que as Cit30 induzem morte por apoptose, as células expostas a PEG30 aparentemente estão numa fase precoce dos mecanismos de apoptose, tal como sugere a análise da expressão génica. As Cit30 foram posteriormente utilizadas para determinar o potencial genotóxico na mesma linha celular, através da determinação do dano no DNA e a indução de micronúcleos (MNi). Foi demonstrado que Cit30 induzem dano no DNA e provocam a ocorrência de MNi, bem como, a redução do Índice de Divisão Nuclear (NDI). Finalmente, e considerando que nesta linha de células a modulação do processo inflamatório é particularmente importante, as células foram expostas a AgNPs de 10 nm com revestimento de citrato ou PEG (Cit10 e PEG10). Os resultados mostraram que Cit10 e PEG10 modularam a resposta inflamatória de forma diferente, onde apenas PEG10 estimulou a indução do Factor Nuclear (NF)- κB. Contudo, ambas as AgNPs não estimularam a produção de citoquinas, mas antes, diminuiram a proteina quimio-atrativa de monócitos -1 (MCP1). A linha celular humana de hepatoma (HepG2) também foi exposta a Cit30 e PEG30 para determinar a influência dos revestimento nos efeitos das AgNPs na viabilidade, apoptose, genes relacionados com a apoptose, ciclo celular e expressão génica de ciclinas. Estas células apresentaram uma sensibilidade similar às AgNPs com ambos os revestimentos, ocorrendo redução de viabilidade e comprometimento do ciclo celular para as concentrações testadas (IC50 e IC20 para as Cit30 que corresponde a 11 μg/mL e 5 μg/mL, respectivamente). A linha celular de macrofágos de ratinho (murganho) (RAW 264.7) foi utilizada para avaliar a citotoxicidade das Cit30, onde a viabilidade, stress oxidativo e as dinamicas do ciclo celular foram determinados. A proliferação e viabilidade das RAW 264.7 apenas decresceu após exposição a concentrações superiores a 75 μg/mL de Cit30, sugerindo uma baixa sensibilidade destas células a baixas concentrações de Cit30. Após exposição de 24 h o conteúdo de ROS (espécies reactivas de oxigénio) diminuiu nas células expostas a 60 μg/mL de Cit30 (IC20) o que pode ter contribuído para a tolerância destas células às AgNPs revestidas de citrato. Contudo, estas células apresentaram o ciclo celular comprometido e foi ainda observado um aumento de células na fase Sub-G1. Este aumento da população Sub-G1 está correlacionado com um aumento da fragmentação do DNA o que sugere um aumento de apoptose nestas células. Assim, e comparando a resposta dos diferentes tipos celulares às AgNPs em termos de viabilidade celular, podemos concluir que os hepatócitos são os mais sensiveis às AgNPs e que os macrófagos parecem ser os mais tolerantes (das mais sensíveis para as mais tolerentes: HepG2>HaCaT>RAW 264.7). Este estudo sugere que o revestimento com PEG pode ser considerado como uma boa alternativa à estabilização das AgNPs com o citrato para a utilização ao nível da indústria e nas aplicações médicas em relação às células da pele humana. Contudo, para os hepatócitos, o potencial citotóxico das AgNPs foi independente dos revestimentos. Para além disso, e considerando que as AgNPs estão presentes num vasto número de produtos de consumo e a sua utilização tem sido provada como útil ao nível industrial e da engenharia biomédica, embora os nossos dados sugiram que no geral PEG-AgNP são menos tóxicas, mais investigação é necessária para determinar as propriedades que conferem menor toxicidade das AgNPs para as diferentes linhas celulares.

Silver nanoparticles (AgNPs) are among the most commonly used engineered NPs due to their physicochemical and biological properties (e.g. efficient antimicrobial activity). There is, however, a growing concern about their putative impact on the environment and on human health. In particular, there is no complete understanding of the influence of the coating on the cytotoxic, inflammatory and genotoxic potential of AgNPs to human cells. In this study, AgNPs coated with citrate or poly(ethylene glycol) (PEG) were used to assess in vitro the influence of coating on the AgNPs toxicity profiles on skin, liver and blood cells. Human Keratinocyte cell line (HaCaT) was exposed to 30 nm AgNPs coated with citrate or PEG (Cit30 or PEG30) and assessed for viability, oxidative stress, cytokine production, apoptosis and cytostaticity. Overall Cit30 was more toxic than PEG30 demonstrating the influence of coating regarding the mode of cell death and cell cycle progression for the concentrations tested (IC50 and IC20 for citrate- AgNPs corresponding to 40 μg/mL and 10 μg/mL, respectively). While Cit30 AgNPs clearly induced apoptotic death, cells exposed to PEG30 AgNPs appeared to be at an earlier phase of apoptosis mechanisms, as supported by gene expression analysis. Later these Cit30 were used to assess genotoxic potential on the same cell line, by measuring DNA damage and micronuclei (MNi) induction. It was demonstrated that Cit30 induced DNA damage, and MNi occurrence as well as a reduction of NDI (Nuclear division index). Finally, and considering that in these cell lines the inflammatory modulation is particularly important, cells were exposed to 10 nm (citrate vs. PEG) AgNPs. Data showed that Cit10 and PEG10 differently modulate the inflammatory response, with only PEG10 stimulating the Nuclear factor (NF)-κB induction. However, both AgNPs did not stimulate the release of cytokines but decreased MCP1 (Monocyte chemoattractant protein-1). Human Hepatoma cell line (HepG2) was also exposed to Cit30 and PEG30 to assess the influence of coating on the AgNPs effects on viability, apoptosis, apoptotic related genes, cell cycle and cyclins gene expression. These cells had similar sensitivity to both coatings, and suffered a decrease of viability as well as an impairment of the cells cycle for the concentrations tested (IC50 and IC20 for citrate- AgNPs corresponding to 11 μg/mL and 5 μg/mL, respectively). Mouse macrophage cell line (RAW 264.7) was used to evaluate the cytotoxicity of Cit30, where viability, oxidative stress and cell cycle dynamics were assessed. The proliferation and viability of RAW 264.7 cells only decreased upon exposure to Cit30 at concentrations above 75 μg/mL, suggesting a low sensitivity of RAW cells to lower doses of these AgNPs. After 24 h exposure, ROS content decreased in cells exposed to 60 μg/mL AgNPs (IC20 value) which can have contributed to the high tolerance of these cells to citrate-AgNPs. However, these cells suffered an impairment of the cell cycle and an increase of cells at Sub-G1 phase was observed. This increase of the subG1 population is correlated with an increase of DNA fragmentation which suggests an increase of apoptosis in these cells. Therefore, and taking together the different decreases on cells viability, we conclude that hepatocytes are more sensitive to AgNPs than keratinocytes and that macrophages seem the more tolerant (from the most sensitive for more tolerant: HepG2>HaCaT>RAW 264.7). This study suggests that PEG-coating can be regarded as a good alternative to citrate stabilization of AgNPs used in industrial and medical applications towards human skin cells. However, for hepatocyte cells, AgNPs cytotoxic potential was coating independent Ultimately, and considering that AgNPs are present in a vast number of consumer products and their use has been proved to be helpful in industrial and biomedical engineering, despite our data suggest that overall PEG-AgNP are less toxic, more research is needed to determine the properties that confer less toxicity of AgNPs to different cell lines.