Multigenerational responses in Daphnia magna: pulse and mixture exposures

Abstract

O aumento da população humana tem levado a um drástico desenvolvimento nos setores da indústria e agricultura. Consequentemente, quantidades elevadas de químicos, incluindo pesticidas, são diariamente produzidos e utilizados, levando à sua inevitável libertação no ambiente. Uma vez nos ecossistemas aquáticos, os organismos podem estar expostos a químicos por períodos de tempo curtos ou longos. O carbendazim, um fungicida extensivamente utilizado nos campos agrícolas, e o triclosan, um composto antibacteriano usado numa variedade de produtos de higiene pessoal, foram escolhidos para o presente trabalho como químicos representantes de origem antropogénica. Vários estudos demonstraram que ambos os químicos estão presentes nas águas superficiais e são prejudiciais para várias espécies aquáticas. Ademais, num cenário real é mais provável que os organismos estejam expostos a misturas de químicos do que a um químico individualmente. Considerando o anteriormente exposto, um dos objetivos do presente estudo foi determinar os efeitos individuais e em mistura do carbendazim e triclosan utilizando o cladócero Daphnia magna, uma espécie modelo amplamente utilizada em ecotoxicologia. Além disso, e considerando que os organismos aquáticos podem estar continuamente expostos a compostos químicos, uma abordagem multigeracional deverá ser considerada. Por este motivo, o presente estudo tem também como objetivo perceber como uma exposição contínua a uma concentração ambientalmente relevante de carbendazim afeta a aptidão da descendência. Para isso, duas experiências multigeracionais foram realizadas, uma até à décima segunda geração (F12) e outra até à décima terceira geração (F13). Adicionalmente, e considerando a libertação dos pesticidas para o ambiente aquático por pulsos, outro objetivo foi perceber como é que a descendência de dáfnias previamente expostas ao carbendazim iria responder a novos pulsos de pesticidas diferentes: a triclosan e à mistura de triclosan e carbendazim. Vários parâmetros individuais, como a sobrevivência, longevidade, imobilização, reprodução e alimentação foram avaliados, assim como alguns parâmetros subcelulares, incluindo genotoxicidade (dano no DNA avaliado pelo ensaio do cometa), diferentes biomarcadores bioquímicos (colinestarase, catalase, glutationa S-transferase e peroxidação lipídica), parâmetros energéticos (lípidos, carboidratos, proteínas e energia disponível e consumida) e, por último, alterações na expressão genética (utilizando um microarray personalizado para D. magna). Na exposição individual, o carbendazim mostrou-se mais tóxico do que o triclosan para a D. magna, e ambos os compostos causaram dano no DNA. Relativamente à exposição a misturas, diferentes parâmetros seguiram diferentes padrões de resposta, desde aditividade: modelo de ação independente (inibição alimentar e reprodução), até desvios dependentes do nível da concentração da mistura (imobilização) e desvios dependentes da razão entre os componentes da mistura, com sinergismo causado principalmente pelo triclosan (dano no DNA). Os impactos multigeracionais do carbendazim para a D. magna foram mais notórios ao nível do dano no DNA (aumentou ao longo das gerações), mudanças na expressão genética e diminuição na longevidade depois de doze gerações. Nas gerações F0 e F12, o carbendazim afetou genes envolvidos na resposta ao stress, replicação e reparação do DNA, neurotransmissão, embriogénese, biossíntese de proteínas, produção de ATP e metabolismo dos lípidos e carboidratos. Considerando os demais parâmetros avaliados, não foi observado um padrão claro de tolerância ao longo das gerações expostas ao carbendazim. No global, as dáfnias em meio limpo e as dáfnias expostas ao carbendazim durante algumas gerações mostraram uma sensibilidade semelhante depois da exposição ao triclosan e também padrões de mistura semelhantes após exposição à mistura binária (carbendazim e triclosan) na experiência por pulsos. O presente estudo realça a importância de usar abordagens multigeracionais (com mais de três gerações) juntamente com múltiplos parâmetros na análise de toxicidade de pesticidas com o objetivo final de melhorar a avalição de risco ambiental.

The human population increase led to a drastic evolution in agricultural and industrial sectors. As a result, high quantities of chemicals, including pesticides, are daily produced and used, leading to their inevitable release into the environment. Once in aquatic ecosystems, organisms can be exposed to chemicals for short and/or long-term periods. Carbendazim, a fungicide used extensively in agricultural fields, and triclosan, an antibacterial compound used in a wide number of personal care products, were chosen in the present work as representative of the man-made chemical disposal. Several studies reported that both chemical compounds are present in surface waters and are harmful to several aquatic species. Additionally, in a real scenario it is most likely for organisms to be exposed to chemical mixtures rather than to single compounds. Taking the above statements into consideration, one of the aims of the present study was to determine the effects of single and combined mixtures of carbendazim and triclosan to the cladocera Daphnia magna, a test-model species widely used in ecotoxicology. Moreover, bearing in mind that aquatic organisms might be continuously exposed to compounds, a multigenerational approach should be considered. Therefore, the present work also aimed at understanding how a continuous exposure to an environmental relevant concentration of carbendazim affects offsprings´ fitness. For that, two multigenerational experiments were conducted, one testing until the twelfth (F12) generation and other testing until the thirteenth (F13) generation. Additionally, and considering the release of pesticides into the aquatic environment by pulses, another challenge was to understand how offspring from daphnids previously exposed to carbendazim respond to new pesticide inputs in two different situations: triclosan alone and the mixture of carbendazim and triclosan. Several individual endpoints, such as survival, longevity, immobilisation, reproduction and feeding activity, were evaluated and also several subcellular endpoints, including genotoxicity (DNA damage evaluated through the comet assay), several biochemical biomarkers (cholinesterase, catalase, glutathione S-transferase and lipid peroxidation), energy-related parameters (lipids, carbohydrates, proteins and available and consumed energy) and finally changes in gene expression (using a D. magna custom microarray). In the single exposure, carbendazim was more toxic to D. magna than triclosan, and both compounds caused DNA damage. Concerning mixture exposures, different endpoints followed different patterns of response, from additivity: Independent Action model (feeding inhibition and reproduction), to deviations for dose level dependency (immobilisation) and dose ratio dependency, with synergism mainly caused by triclosan (DNA damage). Multigenerational impacts of carbendazim to D. magna were mainly observed in terms of DNA damage (increased throughout generations), changes in gene expression and a decrease in longevity after twelve generations. In both F0 and F12 generation, carbendazim affected genes involved in response to stress, DNA replication/repair, neurotransmission, embryogenesis, protein biosynthesis, ATP production, lipids and carbohydrates metabolism. No clear pattern towards tolerance was found throughout the generations exposed to carbendazim regarding the other ecotoxicological endpoints. Overall, daphnids in clean medium and daphnids exposed to carbendazim for some generations showed similar sensitivity after exposure to triclosan and also similar mixture patterns after the binary mixture (carbendazim and triclosan) exposure in the pulse experiment. This research highlights the importance of using multigenerational approaches (with more than three generations) along with multiple endpoints to understand pesticide toxicity with the ultimate goal of improving the environmental risk assessment.