Comparação da citotoxicidade de fármacos anticancerígenos e da sua mistura em células H9c2 diferenciadas

Abstract

Atualmente, as terapias anticancerígenas normalmente consistem na combinação de fármacos e também em outras abordagens terapêuticas como a radioterapia, a cirurgia, entre outras, contribuindo para um prognóstico mais favorável dos doentes com cancro, bem como para a melhoria da sua qualidade de vida. Em contrapartida, o aumento da eficácia clínica é acompanhado por uma elevada incidência de efeitos secundários graves. Os efeitos secundários da quimioterapia são uma das grandes limitações à sua utilização e a cardiotoxicidade é considerada um dos efeitos secundários mais graves da quimioterapia. Esta dissertação teve como objetivo avaliar e comparar a toxicidade da doxorrubicina (DOX), do 5-fluorouracilo (5-FU), da ciclofosfamida (CIC) e da sua mistura (Cyclophosphamide+Adriamycin+5-Fluorouracil, doravante designada CAF) em células H9c2 diferenciadas. Para tal, as células H9c2 diferenciadas foram incubadas com DOX, 5-FU e CIC numa gama de concentrações entre 0-5 μM, durante 24 ou 48 horas. As células H9c2 foram também expostas a concentrações de 10, 25 e 50 μM de 5-FU ou CIC, durante 48 horas. Além disso, as células H9c2 diferenciadas foram incubadas com a mistura CAF nas concentrações de 0,2; 1 ou 5 μM de cada fármaco durante 48 horas. Após o tempo de incubação, foram realizados os seguintes testes de citotoxicidade: teste de redução do brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) e o teste de incorporação do vermelho neutro. A DOX no teste de redução do MTT demonstrou causar citotoxicidade em todas as concentrações testadas, quando comparado com as células controlo, sendo esta citotoxicidade dependente da concentração e mais acentuada para o maior tempo de exposição. No teste de incorporação do vermelho neutro, a DOX provocou citotoxicidade significativa nas concentrações de 0,5; 1; 2,5 e 5 μM, quando comparado com o controlo, sendo a citotoxicidade dependente do tempo de incubação.Relativamente ao 5-FU, após 24 horas de exposição observou-se citotoxicidade no teste de redução do MTT apenas na concentração de 5 μM. Quando as células foram expostas 48 horas ao 5-FU, verificou-se citotoxicidade significativa nas concentrações de 0,5; 1; 2,5 e 5 μM, em comparação com o controlo. No teste de incorporação do vermelho neutro, apenas as concentrações 1; 2,5 e 5 μM de 5-FU causaram toxicidade às células H9c2 diferenciadas. Quando as células foram incubadas com 10, 25 e 50 μM de 5-FU, todas as concentrações testadas causaram citotoxicidade quer esta tenha sido avaliada pelo ensaio de redução do MTT, quer pelo ensaio de incorporação do vermelho neutro. No que diz respeito à CIC, no teste de redução do MTT e às 24 horas, apenas a concentração de 1 μM causou citotoxicidade significativa. Porém, às 48 horas de incubação, as concentrações de 0,13; 0,2; 1 e 5 μM causaram citotoxicidade quando comparado com as células controlo. No teste de incorporação do vermelho neutro não se verificaram diferenças significativas em nenhuma concentração ou tempos de exposição testados, quando comparado com o controlo. No entanto, quando as células H9c2 diferenciadas foram incubadas com 10, 25 e 50 μM de CIC verificou-se toxicidade quando esta foi avaliada pelo teste de redução do MTT; no entanto no teste de incorporação do vermelho não se verificaram quaisquer diferenças significativas nas células expostas a CIC, quando comparado com as células do controlo. No que diz respeito à combinação de fármacos, CAF, esta na concentração de 0,2 μM (de cada fármaco da mistura), causa citotoxicidade de acordo com ambos os testes realizados em células H9c2 diferenciadas, quando comparado com as células do controlo. De facto, a mistura na concentração de 0,2 μM causa citotoxicidade no teste de redução do MTT significativamente maior do que cada um dos compostos isoladamente, quando a citotoxicidade foi avaliada pelo teste de redução do MTT. No teste de incorporação do vermelho neutro, no entanto, não existem diferenças significativas nos níveis de incorporação do corante no interior das células entre a mistura e cada um dos fármacos incubados isoladamente. Quando as células foram incubadas com 1 ou 5 μM de CAF (de cada fármaco da mistura), verificou-se que a toxicidade observada no teste de redução do MTT não era significativamente diferente entre a mistura CAF e qualquer mistura que contenha DOX, ou mesmo a DOX isoladamente. Verificaram-se diferenças significativas apenas entre a mistura e a associação de 5-FU+CIC, e os fármacos 5-FU e a CIC, isoladamente. Concluindo, a DOX, o 5-FU, a CIC e a CAF causam cardiotoxicidade em concentrações na ordem dos micromolar em células H9c2 diferenciadas, apesar dos valores encontrados serem diferentes consoante o teste de citotoxicidade utilizado. A DOX é o fármaco anticancerígeno mais tóxico no modelo celular utilizado, de acordo, com os dois testes de citotoxicidade realizados e parece contribuir de forma significativa para a toxicidade cardíaca da combinação CAF.

Currently, the most common therapeutic approaches for cancer combine drugs and also use other procedures, such as radiation therapy and surgery, among others. The use of combined therapeutics contributes both to attain a better prognosis and to improve the quality of life for people living with cancer. Unfortunately, the increased clinical efficacy of combined approaches is accompanied by a higher incidence of severe side effects. In fact, the use of chemotherapy causes severe side effects, which are major limitations for its use and with cardiotoxicity being considered one of its most serious adverse effects. This dissertation aimed to evaluate and compare the toxicity of doxorubicin (DOX), 5-fluorouracil (5-FU), cyclophosphamide (CIC), and their combination (Cyclophosphamide + Adriamycin + 5-Fluorouracil, herein after referred as CAF) in differentiated H9c2 cardiac cells. Thus, differentiated H9c2 cells were treated with several concentrations of DOX, 5-FU and CIC over a range from 0-5 μM, for 24 or 48 hours. Moreover, the cells H9c2 were treated with CAF mixtures containing 0.2; 1 or 5 μM of each drug during 48 hours. After the incubation period, the cytotoxicity was measured using the reduction of 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) and neutral red incorporation assays. According to the MTT assay, the cells treated with DOX showed cytotoxicity for all concentrations tested when compared with the control, and the cytotoxicity was concentration-dependent and more notorious in the longest time of exposure. In the neutral red assay, when compared to the control, the cellular damage caused by DOX was observed for the concentrations of 0.5; 1; 2.5, and 5 μM and showed to be time-dependent. Regarding 5-FU, after an incubation time of 24 hours only the concentration of 5 μM showed significant toxicity in the MTT assay and the cytotoxicity increased in the longest incubation time. In fact, when the cells were exposed to 5-FU during 48 hours a significant cytotoxicity was shown at the concentrations of 0.5; 1; 2.5 to 5 μM, when compared with control. In the neutral red uptake assay, only the concentrations of 1; 2.5 and 5 μM of 5-FU caused toxicity to differentiated H9c2 cells. Additionally, when the cells were incubated with 10, 25 and 50 μM of 5-FU, all tested concentrations caused cytotoxicity observed on both the MTT reduction and neutral red uptake assays. Concerning CIC, in the MTT reduction assay, cells treated for 24 hours only showed significant cytotoxicity for the concentration 1 μM. However, after 48 hours, significant of incubation the cytotoxicity was observed for the concentrations of 0.13; 0.2; 1, and 5 μM when compared to the control cells. In the neutral red uptake assay, no significant differences were observed for any of the concentrations or exposure periods tested, when compared to the control cells. When differentiated H9c2 cells were incubated with 10, 25, and 50 μM of CIC, toxicity was seen in the MTT reduction assay; whereas for the neutral red uptake assay no significant differences where observed when compared to the control cells. Finally, the combination of drugs, CAF, at a concentration of 0.2 μM (of each drug) causes toxicity in the MTT reduction and neutral red uptake assays performed. In fact, the drugs in combination exhibited a significantly higher cytotoxicity, in the MTT assay when compared with each compound alone at a concentration of 0.2 μM. In the neutral red uptake assay, however, no significant differences were observed for the mixture when compared to each drug by itself. When the cells were treated with 1 and 5 μM of CAF, a significant toxicity was seen in the MTT reduction assay when compared to the control cells. Nevertheless, there were no significant differences between the CAF mixture and any mixture containing DOX, or even DOX alone. In fact, significant differences were only observed between CAF and 5-FU, or CIC or the association 5-FU + CIC. In summary, DOX, 5-FU, CIC, and CAF cause cardiotoxicity in differentiated H9c2 cells when in micro-molar concentrations, although with the assay used show different sensitivities to demonstrate that toxicity. Moreover, according to the results, for the cell model used and with the cytotoxicity assays performed, DOX is the most toxic anticancer drug tested and appears to contribute significantly to the cardiac toxicity of the combination CAF.