Produção de mano-oligossacarídeos através da ß-mananase imobilizada para formulação de ingredientes alimentares

Abstract

Mano-oligossacarídeos (MOS) são hidratos de carbono constituídos por 2 a 10 resíduos de manose, que podem ser obtidos a partir de galactomananas (GM). As GM são polissacarídeos compostos por resíduos de D-manopiranose em ligações (β1→4), que podem estar substituídos em O-6 por resíduos únicos de α-D-galactopiranose. As GM com baixo grau de substituição tendem a ser insolúveis em água e com elevado grau de substituição, se tiverem um grau de polimerização elevado, tendem a formar soluções de alta viscosidade. A hidrólise das GM pela β-mananase permite a produção de MOS, sendo a reutilização da enzima possível se esta estiver imobilizada. Neste trabalho foram utilizadas GM obtidas a partir do resíduo de café (SCG) e da goma de alfarroba. Para solubilizar as GM do SCG foram testadas a hidrólise ácida parcial e a torra, tendo sido obtidas, por ambas as metodologias, GM solúveis. Estas GM solúveis foram caracterizadas por análise de açúcares neutros, análise de ligações glicosídicas e cromatografia de exclusão molecular. Foi também analisada uma amostra de GM solúvel de SCG, obtida por extração assistida por micro-ondas. A β-mananase, de origem comercial foi imobilizada usando a quitina, obtida previamente a partir das cascas de camarão, como suporte. Usou-se como reagente bi-funcional a genipina. A percentagem de imobilização foi de 36%. A atividade da enzima foi avaliada, utilizando como substrato as GM do SCG e monitorizada pela formação de manobiose por cromatografia em fase gasosa acoplada a deteção por ionização de chama (GC-FID). A formação de trissacarídeos (Man3 e Gal-Man2) e outros MOS também foi avaliada por GC-FID e por cromatografia de exclusão molecular. Os parâmetros cinéticos da β-mananase livre e imobilizada foram determinados por hidrólise das GM de SCG e formação de manobiose. Estes foram calculados a partir da equação de Lineweaver-Burk. A enzima livre apresentou uma Vmáx de 10,5 mmol/min e um Km de 0,047 mg/mL. No caso da enzima imobilizada a Vmáx (6,4 mmol/min) foi ligeiramente inferior à da enzima livre, enquanto que o Km (1,57 mg/mL) foi 30 vezes superior. A β-mananase imobilizada foi utilizada para a produção de MOS a partir de GM de goma de alfarroba (LBG), tendo-se verificado a formação de trissacarídeos e tetrassacarídeos, para além de MOS de maior tamanho, não tendo, no entanto, sido produzidos dissacarídeos. Os MOS produzidos a partir das GM do SCG e da LBG não apresentaram citotoxicidade com células do baço de ratinho. No entanto, não foi observada atividade imunoestimuladora. Foi também avaliada a atividade prebiótica para a estirpe Lactobacillus casei ssp. paracasei não se tendo verificado atividade prebiótica.

Mano-oligosaccharides (MOS) are carbohydrates consisting of 2 to 10 mannose residues that can be obtained from galactomannans (GM). GM are polysaccharides composed by (β1→4) linked D-mannopyranose residues that can be substituted at O-6 with single residues of α-D-galactopyranose. GM with low degree of substitution tend to be insoluble in water whereas GM with high degree of substitution, and high degree of polymerization, tend to form high viscosity solutions. Hydrolysis of GM with β-mannanase allows the production of MOS, and enzyme immobilization allows its reuse. In this study, GM obtained from spent coffee grounds (SCG) and also from locust bean gum (LBG) were used. To render them soluble in water, a pretreatment of GM of the SCG by partial acid hydrolysis and also by roasting was tested. The efficiency of pretreatment was evaluated by neutral sugar analysis, analysis of glycosidic bonds and molecular exclusion chromatography. The sample of SCG previously obtained by microwave assisted extraction was also analyzed. The β-mannanase from commercial sources was immobilized on chitin, as support, previously obtained from shrimp shells. Genipin was used as bifunctional reagent. The percentage of enzyme immobilization was 36%. The enzyme activity was measured by gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID) through the formation of mannobiose from galactomannans of the SCG. The formation of trisaccharides (Man3 and Gal-Man2) and other MOS was also evaluated by GC-FID and size exclusion chromatography. The kinetic parameters of both free and immobilized β-mannanase were determined by hydrolysis of GM of the SCG and mannobiose formation, calculated from Lineweaver-Burk equation. The free enzyme showed a Vmax of 10.5 mmol/min and Km of 0.047 mg/mL. In case of the immobilized enzyme the Vmax (6.4 mmol/min) was slightly lower than the free enzyme, while the Km (1.57 mg/mL) was 30 times higher. The activity of immobilized β-mannanase was tested in GM of the LBG, allowing to obtain tetrasaccharides and trisaccharides, as well as other major MOS. However, disaccharides have not been produced. The MOS obtained by hydrolyses of GM of the SCG and LBG trough β-mannanase immobilization did not show cytotoxicity against mouse spleen cells. However, no immunostimulatory activity was observed. Prebiotic activity was also evaluated for the strain Lactobacillus casei ssp. paracasei prebiotic activity was not verified.