Estudo exploratório das potencialidades de Corophium multisetosum para avaliação toxicológica

Abstract

O Corophium multisetosum é um anfípode presente na Ria de Aveiro, cuja utilização como espécie indicadora em testes de toxicidade sedimentar por ensaios de sobrevivência e ciclo de vida completo tem sido objecto de estudo. O presente trabalho explora outras potencialidades do Corophium multisetosum para avaliação toxicológica. Neste estudo, homogeneizados do corpo total de Corophium multisetosum foram utilizados para quantificação da actividade de LDH, da actividade de AChE e de aminoácidos livres. Durante a fase de optimização das condições experimentais, foram também utilizados homogeneizados de cérebro e fígado de ratinho para validação das técnicas adoptadas. Verificouse que os homogeneizados de corpo total de indivíduos mantidos em cultura e seleccionados por crivagem em malha de 0,5 mm exibem níveis de actividade de LDH e de AChE de, respectivamente, 0,0185 + 0,0023 Ulmg prot. e 3,8 I 0,2 nmol TCWmin/mg prot. A caracterização mais detalhada da AChE permitiu estabelecer algumas propriedades desta enzima em Corophium multisetosum, nomeadamente, %, = 60 f 2 pM, V,, = 5,O I 0,9 nmol TCWmin/mg prot. T s 40' C e pH óptimo > 8,03. A análise dos aminoácidos livres facultou o estabelecimento de alguns parâmetros com interesse na avaliação toxicológica: concentração total de aminoácidos - 16,62 f 1,75 nmol/mg prot.; razão taurina:glicina - 1,38 I O,11; concentração de treonina + serina - 0,97 1 0,05 nmol/mg prot.; níveis de aspartato e alanina - 0,63 + 0,11 nmol/mg prot. e 2,59 f 0,15 nmol/mg prot., respectivamente. Com a finalidade de avaliar a viabilidade e o interesse dos biomarcadores referidos em ensaios de toxicidade com Corophium multisetosum, realizou-se um estudo comparativo de três abordagens distintas de avaliação da toxicidade do HgC12 e do CdC12: ensaios de sobrevivência, msaios de quantificação dos biomarcadores em homogeneizados do corpo total após exposição (in vivo) de culturas de Corophium multisetosum e após incubação (in vitro) na presença de 3 diferentes concentrações de HgCl2 e de CdC12. Os resultados obtidos nesta fase do trabalho indicam que as actividades de LDH e de AChE quando medidas em homogeneizados do corpo total dos indivíduos sobreviventes após exposições a estes compostos se correlacionam com a letalidade manifestada nos ensaios de sobrevivência. Aumentos significativos da actividade da LDH são registadas para concentrações de HgC12 e de CdC12 1,5 e 2 vezes inferiores às necessárias para alterar a sobrevivência de Corophium multisetosum. Contrariamente, reduções dos níveis de actividade de AChE só são observadas para condições em que o índice de mortalidade é já elevado. A quantifícação dos aminoácidos livres e consequente cálculo dos parâmetros indicadores de stress e anóxia indicou que as exposições a HgC12 e CdCL produzem situações de stress e anóxia em Corophium multisetosum acompanhadas da eventual estimulação de vias alternativas à fosforilação oxidativa. Finalmente, o estudo conduzido no sentido de detectar a presença da via metabólica Larginina : NO e, consequentemente, a sintase do NO, revelou que a sobrevivência do Corophium multisetosum em cultura é diminuída por SNP de uma maneira dependente da concentração. Recorrendo aos marcadores utilizados anteriormente, verificou-se que a breve exposição de culturas de Couophium multisetosum a uma concentração letal (1 mM) de SNP provoca a elevação dos níveis de actividade da LDH (50%), da AChE (81%) e o aumento da concentração total dos aminoácidos livres (59%). Porém, concentrações sub-letais de SNP não produzem alterações significativas dos parâmetros mencionados, mas sim uma redução acentuada dos níveis de glutamina, glutamato, histidina e treonina em simultâneo com o aumento dos níveis de lisina. Respostas similares (aumento da actividade de ACE, redução das concentrações de glutamina, glutamato, bistidina e treonina e aumento da concentração de lisina) bem como redução da razão arginina:citrulina e aumento de proteínas citosólicas de peso molecular superior a 116000 Daltons foram observadas em resultado da exposição, durante 10 dias, de culturas de Corophium multisetosum ao par indutor da isoforma indutiva da sintase do NO: LPS (2 mg/l) e Interferon (60 unidades/ ml).