Development of lyophilized reference stock cultures for quality control in microbiological analysis

Abstract

No final de 2014 foi publicada a norma ISO 11133 que obriga à realização de testes de performance em todos os lotes de meio produzidos, recorrendo ao uso de microrganismos de referência específicos, com um nível de inóculo estabelecido. A liofilização é um processo de secagem de culturas microbianas, e que permite a sua preservação por largos períodos de tempo, sem ser necessária refrigeração. Os efeitos de três meios crioprotetores diferentes (skim milk + 10% sacarose, nutrient broth nº2 + 20% glicerol, e sacarose 10%) na sobrevivência à liofilização de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Salmonella enterica serogrupo Typhimurium; o acompanhamento da concentração celular de S. aureus ao longo do tempo, depois de ter sido liofilizado com skim milk + 10% sacarose; e ainda o estudo da estabilidade de E. coli e S. aureus, depois de liofilizados e armazenados à temperatura ambiente, foram investigados. E. coli, S. aureus e L. monocytogenes foram liofilizadas com skim milk + 10% sacarose; E. coli e S. aureus foram liofilizadas com nutrient broth nº2 + 20% glicerol; e Salmonella Typhimurium e E. coli foram liofilizadas com sacarose 10%. Terminadas as liofilizações dos estudos de viabilidade, cada amostra foi reidratada e inoculada em PCA. Para o acompanhamento da concentração celular de S. aureus, com intervalos regulares ao longo do tempo, as amostras foram reidratadas e inoculadas em PCA e BP egg yolk. Para estudar a estabilidade de E. coli e S. aureus as amostras foram reidratadas e inoculadas em PCA e no respetivo meio seletivo, com intervalos regulares ao longo do tempo. Skim milk + 10% sacarose é o melhor meio protetor dos três usados. Das bactérias gram-positivas testadas, L. monocytogenes é a mais resistente, com uma redução na sua viabilidade virtualmente nula; das gram-negativas, a Salmonella Typhimurium foi a que obteve melhores resultados, com a redução de 1 Log. Naturalmente, as gram-positivas têm uma melhor capacidade de sobrevivência à liofilização por causa da composição da sua parede celular, rica em peptidoglicanos, e isso foi comprovado nos testes feitos. No estudo da estabilidade de S. aureus, a sua concentração celular manteve-se estável ao longo do tempo, acima dos 6 Log ufc/200 μl. Nos estudos em que a estabilidade de E. coli e S. aureus armazenados à temperatura ambiente foi avaliada, comprovou-se que culturas microbianas liofilizadas necessitam de refrigeração para manter a viabilidade. Com este trabalho deu-se início à investigação necessária para a elaboração de um protocolo com o intuito de produzir culturas stock de referência liofilizadas, com o nível de inóculo necessário, para aplicação futura em análises microbiológicas.

In late 2014 it was published the standard ISO 11133 which obligates the achievement of performance tests in every batch of media produced, resorting to specific reference microorganisms, with an established inoculum level. Lyophilization is a drying process applied to microbial cultures that allows its preservation for large periods of time, with no refrigeration needed. The effects of three different cryoprotective media (skim milk + 10% sucrose, nutrient broth no2 + 20% glycerol, and sucrose 10%) on survival to lyophilization of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar Typhimurium; a monitoring of S. aureus cell concentration over time, after being lyophilized with skim milk + 10% sucrose; and also a stability study of E. coli and S. aureus after lyophilization and storage at room temperature, were investigated. E. coli, S. aureus and L. monocytogenes were lyophilized with skim milk + 10% sucrose; E. coli and S. aureus were lyophilized with nutrient broth no2 + 20% glycerol; and Salmonella Typhimurium and E. coli were lyophilized with sucrose 10%. Finished every lyophilization of the viability studies, each sample was rehydrated and inoculated in PCA. To monitor S. aureus cell concentration, the samples were rehydrated and inoculated in PCA and BP egg yolk, with regular intervals throughout time. For the stability study of E. coli and S. aureus, also in regular intervals, samples were rehydrated and inoculated in PCA and in the respective selective culture media. Skim milk + 10% sucrose is the best cryoprotective medium used. From the gram-positive bacteria tested, L. monocytogenes is the most resistant, registering a virtually null reduction in viability; from gram-negative, Salmonella Typhimurium performed best, with only 1 Log reduction. Naturally, gram-positive bacteria have a better survivability to lyophilization because of their cell wall composition, rich in peptidoglycan, and that was proven with the experiments performed. In S. aureus stability study, cellular concentration was kept stable over time, above 6 Log cfu/200μl. In the stability studies in which E. coli and S aureus were storage at room temperature, it has been proved that lyophilized microbial cultures require lyophilization to maintain viability. This work initiated the research needed for the elaboration of a protocol intended for the production of lyophilized reference stock cultures, with a specific inoculum level, for future application in microbiological analyses.