Regulation of peroxisome biogenesis and proliferation: characterization of Pex16p and Pex11pβ

Abstract

Peroxisomes are multifunctional organelles involved in various metabolic processes. The numerous severe disorders lead by peroxisomal malfunction in addition to the increasing evidences of the involvement of peroxisomes in several pathologies, from neurodegeneration to cancer and viral infection, renders this organelle an essential role for human health and development. Furthermore, peroxisomes are highly dynamic, adjusting their protein content, morphology and number in response to cellular needs. Peroxisome dynamics and their proper regulation are closely linked to organelle function and thus, human well-being. So that the study of the mechanisms that regulate peroxisomal biogenesis and proliferation is primordial. Being reversible phosphorylation a major intracellular control mechanism in eukaryotes with PP1 as the prominent player in dephosphorylation events, it is very likely that it represents an important regulation mechanism also in peroxisomes. As a matter of fact, some evidences in that direction have emerged, although they are still very scarce and mostly not for human cells. Interestingly, a large-scale blot screen on rat peroxisomes revealed the presence of several kinases and phosphatases, being PP1 one of them. The main goal of this thesis was to study the role of reversible phosphorylation in human peroxisomes through a very likely PP1 regulator, Pex16p, and a putative phosphorylated protein, Pex11pβ. Pex16p and Pex11pβ are essential players in the peroxisome biogenesis, elongation and division. Our studies were not able to verify a putative interaction between PP1 and Pex16p. S11 and S38 residues of Pex11pβ have also been demonstrated to not be involved in its regulation by putative phosphorylation. The regulation by key cysteines in Pex11pβ was also investigated, revealing that C18, C25 and C85 are apparently not involved in such mechanism. A possible role for an intriguing glycine-rich stretch in the intraperoxisomal region of Pex11pβ was also studied, with inconclusive results, being that it appears to be dispensable for Pex11pβ-driven peroxisomal growth and division. Our study also focused on the Pex11pβ N-terminally located amphipathic helices, reveling Helix 2 as essential for peroxisomal membrane elongation, with a probable involvement in the Pex11pβ dimerization process. Although with several negative results, our study opened some doors towards a better understanding of the mechanisms that regulate peroxisome biogenesis and proliferation. New protein-protein interaction methods which developed meanwhile may be useful to verify the likely transient PP1-Pex16p interaction. Moreover, we verified that other peroxins have putative PP1-binding motifs, representing possible further interconnectors between intracellular signal transduction and peroxisomes. Concerning Pex11pβ mechanisms of action and regulation, our study raised the hypothesis that other domains are involved in the elongation function since we demonstrated that N-terminal region in not sufficient to promote peroxisomal membrane elongation. We also propose that the inter-transmembrane domains area may be at least partially embedded within the lipid bilayer, defying the preconceived topology of this region of Pex11pβ. We further propose that other phosphorylation- and key cysteinesdriven Pex11pβ regulation is still an open field since that other residues present as potentially active in such processes. Our study brought valuable insights in the mysterious regulation mechanisms of peroxisomes, essential organelles for cellular function, with serious consequences for human health.

Os peroxissomas são organelos multifuncionais e estão envolvidos em diversos processos metabólicos. As várias doenças graves provocadas por mau funcionamento dos peroxissomas e as crescentes evidências do seu envolvimento em várias patologias, desde a neurodegeneração, ao cancro e infeção viral, confere a este organelo um papel fundamental na saúde e desenvolvimento humanos. Os peroxissomas são extremamente dinâmicos, ajustando o seu número, morfologia e conteúdo proteico em resposta às necessidades da célula. A dinâmica peroxissomal, associada à sua devida regulação, está intimamente relacionada com a função deste organelo e, consequentemente, ao bem-estar humano. Assim sendo, o estudo dos mecanismos que regulam a biogénese e a proliferação dos peroxissomas é de extrema importância. Sendo a fosforilação reversível um dos principais mecanismos de controlo intracelular em eucariontes, tendo a PP1 um papel proeminente em eventos desfosforilativos, é altamente provável que seja um mecanismo importante na regulação também dos peroxissomas. De facto, têm surgido algumas evidências nesse sentido, embora sejam ainda muito escassas e não em células humanas. Interessantemente, um estudo em peroxissomas de rato revelou a presença de várias cinases e fosfatases, entre elas a PP1. O principal objetivo desta tese foi estudar o papel da fosforilação reversível nos peroxissomas humanos, através de um provável regulador da PP1, a Pex16p, e uma proteína potencialmente fosforilada, a Pex11pβ. Estas peroxinas são peças fundamentais na biogénese, crescimento e divisão dos peroxissomas. Os nossos estudos não confirmaram a interação putativa PP1Pex16p e os resíduos S11 e S38 da Pex11pβ também não se revelaram envolvidos na sua regulação através de eventual fosforilação. Também investigámos uma possível regulação da Pex11pβ através de cisteínas-chave, sendo que C18, C25 e C85 não estão, aparentemente, envolvidas. Uma possível função para a intrigante zona rica em glicinas localizada na região intraperoxissomal também foi estuda, traduzindo resultados inconclusivos, sendo que esta parece ser dispensável ao crescimento e divisão dos peroxissomas induzidos por Pex11pβ. Também nos debruçámos sobre as hélices anfipáticas localizadas no N-terminal da Pex11pβ e verificámos que a hélice 2 é essencial para o alongamento da membrana peroxisomal, com provável envolvimento no processo de dimerização. Apesar de vários resultados serem negativos, o nosso estudo abriu alguns caminhos em direção a uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a biogénese e proliferação dos peroxissomas. Novos métodos de deteção de interações proteína-proteína desenvolvidos recentemente poderão ser úteis para verificar a interação PP1-Pex16p que, provavelmente será transiente. Além disso, constatámos que existem outras peroxinas com motivos de ligação à PP1, representando assim possíveis novos elos entre mecanismos de transdução de sinais intracelulares e peroxissomas. Também propomos a existência de outros domínios na Pex11pβ envolvidos na função de alongamento, uma vez que a região N-terminal, por si só, não é suficiente para promover o alongamento da membrana do peroxissoma. Também propomos que a zona inter-domínios transmembranares da Pex11pβ está, pelo menos parcialmente, embebida na bi-camada lipídica, desafiando a topologia pré-concebida. Mecanismos de regulação da Pex11pβ dirigidos por cisteínas e fosforilação continuam também a ser hipóteses em aberto, pois outros resíduos podem tomar parte nesses processos. O nosso trabalho trouxe dados importantes para o estudo dos enigmáticos mecanismos de regulação dos peroxissomas, organelos essenciais à função celular, com sérias consequências na saúde humana.