Changes of the microbial communities as a mean to evaluate the impact of soil contamination by nanoparticles

Abstract

Silver nanoparticles (AgNPs) are broadly used in the industry due to AgNPs’ antibacterial proprieties. Uncontrolled released of AgNPs and persistence in the environment might enhance the concern of soil contamination by AgNPs. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the effects of AgNPs on the bacterial communities using two complementary approaches: a culture-independent method [Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE)] and a culture-dependent method (disc diffusion to analyze the bacterial susceptibility). To explore this aim, the bacterial communities of the LUFA 2.2 soil was exposed to 5 µg/kg of AgNPs or silver cation (Ag+, provided as AgNO3) during 56 days. The analysis of the soil bacterial communities by PCR-DGGE included those retrieved from soil at 42 and 56 days as well as those developed in the presence and absence of Porcellionides pruinosus. For the susceptibility tests, only the soil bacterial communities retrieved from soil at 56 days were analyzed. The first method enabled to investigate the effects of AgNPs or Ag+ on the bacterial community of soil and to understand if these effects changed with the presence of P. pruinosus or along the exposure period. The second methodology provided an analysis of the viable soil bacterial community and allowed to assess the susceptibility responses of the soil bacterial communities according to the silver form (AgNPs or Ag+), silver amounts (10 µg, 1 µg or 0.1 µg), joint exposure to AgNPs and Ag+ and after previous exposure to silver. By using PCR-DGGE, we demonstrated that the silver forms (AgNPs and Ag+), exposure period (42 or 56 days) and the presence of P. pruinosus were relevant to alter the structure of soil bacterial community. P. pruinosus showed to be probably useful to minimize the effects of silver cation for exposures close to 2 months; yet, even in the presence of this isopod, the AgNPs might still be a risk for the soil bacterial communities. By using disc diffusion method we provided an analysis of the viable soil bacterial community demonstrating that the silver form, the amount and the combination of both silver forms affected the susceptibility of the soil bacterial communities. Bacteria were more susceptible to Ag+ than to AgNPs and amount-dependent as well as addition effects were demonstrated. Although the bacterial communities being analyzed by the two methods were different, overall patterns were identified: bacteria are affected by both silver forms, particularly by showing altered community structure and showing susceptibility through growth inhibition. Yet, lower concentrations than those herein tested are imperative to be considered in future investigations as we obtained most of the susceptibility changes for exposures with lower amounts (1 and 0.1 µg). Compared to silver cation, the AgNPs appears to affect less the soil bacterial communities. Thus, this thesis strengthens how valuable is to use these communities to evaluate the effects of the soil contamination as they proved to be sensible to silver contamination by both methodologies.

As nanopartículas de prata (AgNPs) são muito utilizadas na indústria devido às suas propriedades antibacterianas. A libertação de forma não controlada das AgNPs para o ambiente e a sua persistência no mesmo, aumentam a preocupação em relação à contaminação dos solos por AgNPs. Assim, o objetivo desta tese foi analisar os efeitos das AgNPs nas comunidades bacterianas do solo recorrendo a duas abordagens complementares: uma independente do cultivo [Polymerase Chain Reaction- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE)] e outra dependente do cultivo (método de difusão por discos para analisar a suscetibilidade bacteriana). Para dar cumprimento a este objectivo, as comunidades bacterianas do solo LUFA 2.2 foram expostas a 5 µg/kg de AgNPs ou de catião prata (Ag+, disponibilizado como AgNO3) durante 56 dias. A análise das comunidades bacterianas do solo por PCR-DGGE foi feita para 42 e 56 dias e na presença e ausência do Porcellionides pruinosus. Para os testes de suscetibilidade, apenas as comunidades bacterianas do solo para 56 dias foram analisadas. O primeiro método possibilitou investigar os efeitos das AgNPs ou Ag+ nas comunidades bacterianas do solo e compreender se estes efeitos alteravam com a presença do P. pruinosus ou ao longo do tempo de exposição. O segundo método permitiu avaliar a resposta de suscetibilidade das comunidades bacterianas do solo atendendo à forma (AgNPs ou Ag+) e quantidade (10 µg, 1 µg ou 0.1 µg) da prata, à exposição conjunta e após reincidência da contaminação por prata. Com o PCR-DGGE demostrou-se que a forma da prata (AgNPs ou Ag+), o período de exposição (42 ou 56 dias) e a presença do P. pruinosus foram relevantes para a alteração da comunidade bacteriana do solo. O P. pruinosus poderá ser, provavelmente, útil para a bioremediação de catião prata para exposições perto dos 2 meses; ainda assim, mesmo na presença deste isópode, as AgNPs poderão constituir um risco para as comunidades bacterianas do solo. Através do método de difusão por discos foi possível disponibilizar uma análise da fracção viável das comunidades bacterianas do solo demonstrando que a forma, quantidade e combinação de ambas as formas de prata afectaram a suscetibilidade das comunidades bacterianas do solo. As bactérias mostraram ser mais suscetíveis Ag+ do que às AgNPs sendo também possível observar uma resposta dependente da quantidade além do efeito aditivo para a exposição combinada. Apesar dos efeitos das nanopartículas de prata nas comunidades bacterianas terem sido analisadas por dois métodos, foram identificados alguns padrões: as bactérias foram afetadas por ambas as formas de prata, mostrando que quer a estrutura da comunidade quer a suscetibilidade eram alteradas. É imperativa a análise de baixas quantidades em investigações futuras, além das testadas nesta tese, já que a resposta de suscetibilidade alterou-se para exposição prévia a contaminações com quantidades baixas (1 e 0.1 µg). Comparativamente com o catião de prata, as AgNPs parecem afetar menos as comunidades bacterianas do solo. Assim, esta tese reforça o quão valioso é usar estas comunidades para avaliar os efeitos da contaminação no solo, já que provaram ser sensíveis à contaminação de prata pelas duas metodologias.