Functional analysis of String/CDC25 phosphatase in post-mitotic neurons

Abstract

Cell cycle and differentiation are two highly coordinated processes during organ development. Recent studies have demonstrated that core cell cycle regulators also play cell cycle-independent functions in post-mitotic neurons, and are essential for the maintenance of neuronal homeostasis. CDC25 phosphatases are well-established CDK activators and their activity is mainly associated to proliferating tissues. The expression and activity of mammalian CDC25s has been reported in adult brains. However, their physiological relevance and the potential substrates in a non-proliferative context have never been addressed. string (stg) encodes the Drosophila CDC25 homolog. Previous studies from our group showed that stg is expressed in photoreceptors (PRs) and in lamina neurons, which are two differentiated cell types that compose the fly visual system. The aims of this work are to uncover the function of stg and to identify its potential neuronal substrates, using the Drosophila visual system as a model. To gain insight into the function of stg in a non-dividing context we used the GAL4/UAS system to promote downregulation of stg in PR-neurons, through the use of an RNAi transgene. The defects caused by stg loss-of-function were evaluated in the developing eye imaginal disc by immunofluorescence, and during adult stages by scanning electron microscopy. This genetic approach was combined with a specific proteomic method, two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), to identify the potential substrates in PR-cells. Our results showed that stg downregulation in PRs affects the well-patterned retina organization, inducing the loss of apical maintenance of PR-nuclei on the eye disc, and ommatidia disorganization. We also detected an abnormal accumulation of cytoskeletal proteins and a disruption of the axon structure. As a consequence, the projection of PR-axons into the lamina and medulla neuropils of the optic lobe was impaired. Upon stg downregulation, we also detected that PR-cells accumulate Cyclin B. Although the rough eye phenotype observed upon stg downregulation suggests neurodegeneration, we did not detect neuronal death during larval stages, suggesting that it likely occurs during pupal stages or during adulthood. By 2D-DIGE, we identified seven proteins which were differentially expressed upon stg downregulation, and are potential neuronal substrates of Stg. Altogether, our observations suggest that Stg phosphatase plays an essential role in the Drosophila visual system neurons, regulating several cell components and processes in order to ensure their homeostasis.

O ciclo celular e a diferenciação são dois processos altamente coordenados durante o desenvolvimento dos órgãos. Estudos recentes demonstraram que os reguladores do ciclo celular também desempenham funções independentes do ciclo celular em neurónios pós-mitóticos e são essenciais para a manutenção da homeostasia neuronal. As fosfatases CDC25 são conhecidas como ativadores de CDKs e a sua atividade está principalmente associada a tecidos em proliferação. A sua expressão e atividade têm sido descritas em cérebros adultos de mamíferos. Contudo, a sua relevância fisiológica e os seus potenciais substratos nunca foram abordados num contexto não proliferativo. O homólogo de CDC25 em Drosophila é codificado por string (stg). Estudos prévios do nosso grupo mostram que stg é expresso nos fotorreceptores e nos neurónios da lâmina, que são dois tipos celulares diferenciados que constituem o sistema visual da mosca. Os objetivos deste trabalho são identificar a função de stg e os seus potenciais substratos neuronais, utilizando o sistema visual de Drosophila como modelo. Para obter informação acerca da função de stg utilizámos o sistema GAL4/UAS para reduzir a expressão de stg nos fotorreceptores, através de um transgene RNAi. Os defeitos provocados pela perda de função de stg foram avaliados no disco imaginal do olho por imunofluorescência, e durante a fase adulta por microscopia eletrónica de varrimento. Esta abordagem genética foi acoplada a uma técnica de proteómica específica, eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), para identificar os substratos de Stg nos fotorreceptores. Os nossos resultados mostraram que a redução da expressão de stg nos fotorreceptores afetou o padrão de organização da retina, induzindo a perda da manutenção apical do núcleo dos fotorreceptores no epitélio do disco do olho e a desorganização dos omatídios. Também detetámos uma distribuição anormal de proteínas do citoesqueleto e destabilização da estrutura axonal. Consequentemente, a projeção dos axónios para os neurópilos da lâmina e médula do lobo óptico foi perturbada. Após a redução de expressão de stg, observamos também que os fotorreceptores acumularam Ciclina B. Apesar do fenótipo olho rugoso observado após redução da expressão de stg sugerir neurodegeneração, não detetámos morte neuronal durante a fase larvar, sugerindo que provavelmente ocorre durante a fase de pupa ou do desenvolvimento do adulto. Através da análise por 2D-DIGE identificámos sete proteínas com expressão diferencial que constituem potenciais substratos de Stg nos fotorreceptores. Em conjunto, as nossas observações sugerem que a fosfatase Stg desempenha uma função essencial em neurónios do sistema visual de Drosophila, regulando vários componentes e processos celulares para manter a sua homeostasia.