Synthesis and characterization of silver nanoparticles: a toxicity and metabolomics approach in skin cells

Abstract

As nanopartículas de prata (AgNPs) apresentam uma vasta gama de aplicações devido às suas inerentes propriedades físico-químicas e atividade biológica. Para além disso, a síntese verde de nanopartículas está a ser estudada como uma alternativa fiável e promissora para minimizar a utilização de substâncias prejudiciais utilizadas na síntese convencional. No presente trabalho, as AgNPs foram sintetizadas usando extratos de casca de Eucalyptus globulus e comparados com as sintetizadas por "Pulsed Laser Abalation in Liquids" (PLAL). Ambos os conjuntos de nanopartículas foram caracterizados por espectroscopia de UV-Visível, dispersão dinâmica de luz (DLS) e microscopia eletrónica de varrimento (SEM). A concentração de prata nas soluções aquosas de NPs foi avaliada por análise de Espectrometria de Emissão Ótica por Plasma Acoplado Indutivamente (ICP-OES). A toxicidade das partículas na linha celular de queratinócitos humanos, HaCaT, foi avaliada pelo ensaio convencional de MTT, para avaliação da viabilidade celular, e o ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo. Finalmente, o perfil metabólico das células foi avaliado por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR) e análise multivariada (metabolómica). Os resultados da caracterização mostraram que as AgNPs foram de facto formadas e apresentaram uma ampla distribuição de diâmetros de aproximadamente 30 a 70 nm no caso das nanopartículas produzida por síntese verde (GS) e de 10 nm com distribuição estreita para as sintetizadas via PLAL. As partículas dispersas em meio de cultura celular apresentaram ligeira aglomeração, enquanto o armazenamento à temperatura ambiente não induziu nenhum efeito no tamanho final. Contudo, o “envelhecimento” resultou na formação de uma pequena quantidade de nanoestruturas com formato de agulha. O MTT indicou um IC50 para as células HaCaT de aproximadamente 15 g/mL no caso das AgNPs preparadas por síntese verde e de 24 g/mL no caso das NPs sintetizadas via PLAL. As partículas de GS também induziram redução da proliferação na dose mais baixa e extensa morte celular na dose mais elevada, com a análise do ciclo celular mostrando paragem na fase G2. Os revestimentos quer das nanopartículas de GS, quer de PLAL não induziram toxicidade nas concentrações testadas, e a interferência de AgNPs com o ensaio de MTT foi considerada insignificante. A análise metabolómica revelou que as AgNPs em concentrações sub-tóxicas causaram alterações a nível do metabolismo energético, proteção antioxidante e membranas celulares.

Silver nanoparticles (AgNPs) present a wide range of applications due to their inherent physiochemical properties and biological activities. Moreover, green synthesis of metal nanoparticles is being studied as a reliable and promising alternative to minimize the use of harmful substances usually used in conventional synthesis. Here, AgNPs were synthesized using Eucalyptus globulus bark extract (GS) and compared against those synthesized externally via Pulsed Laser Abalation in Liquids (PLAL) technique. Both sets of particles were then characterized using UV-Visible spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), and scanning transmission electron microscopy (SEM). The silver concentration of the aqueous solutions of NPs was also assessed by ICP-OES analysis. The toxicity of the particles on the human keratinocyte cell line, HaCaT, was evaluated using MTT, a conventional viability assay and cell cycle analysis was performed using flow cytometry. Finally, cellular metabolomics profiling was evaluated using NMR spectroscopy and multivariate analysis. Characterization results showed that AgNPs were indeed formed; presenting diameters of approximately 30 to 70 nm, and a wide size distribution for the GS route and 10 nm with a narrow distribution for the PLAL synthesis. Dispersion of particles in cell culture media promoted a slight agglomeration, while aging of particles at room temperature did not have an effect on their final size. Nevertheless, this aging time resulted in the formation of a small amount of needle-like nanostructures. MTT results indicated an IC50 value of approximately 15 ug/mL of silver for the GS route and approximately 24 ug/mL for the PLAL AgNPs. The GS particles also induced slower proliferation at the low concentration and extensive cell death at the high concentration, with cell cycle analysis showing arrest at the G2 phase. Neither the coating from the GS, nor the PLAL particles induced any toxicity at the concentrations tested, and the interference of AgNPs with the MTT assay was found to be negligible. Metabolomics using 1H NMR revealed that sub-toxic concentrations also caused significant alterations in energy metabolism, membrane modifications, and antioxidant protection in a dose and particle dependent manner. More specifically, GSH levels saw an increase, whereas amino acids, creatine compounds, and choline compounds all saw decreases. The GS AgNPs induced a stronger response in HaCaT cells than that of the PLAL.