Codon ambiguities as a mechanism to alter the genetic code in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Although the genetic code is generally viewed as immutable, alterations to its standard form occur in the three domains of life. A remarkable alteration to the standard genetic code occurs in many fungi of the Saccharomycotina CTG clade where the Leucine CUG codon has been reassigned to Serine by a novel transfer RNA (Ser-tRNACAG). The host laboratory made a major breakthrough by reversing this atypical genetic code alteration in the human pathogen Candida albicans using a combination of tRNA engineering, gene recombination and forced evolution. These results raised the hypothesis that synthetic codon ambiguities combined with experimental evolution may release codons from their frozen state. In this thesis we tested this hypothesis using S. cerevisiae as a model system. We generated ambiguity at specific codons in a two-step approach, involving deletion of tRNA genes followed by expression of non-cognate tRNAs that are able to compensate the deleted tRNA. Driven by the notion that rare codons are more susceptible to reassignment than those that are frequently used, we used two deletion strains where there is no cognate tRNA to decode the rare CUC-Leu codon and AGG-Arg codon. We exploited the vulnerability of the latter by engineering mutant tRNAs that misincorporate Ser at these sites. These recombinant strains were evolved over time using experimental evolution. Although there was a strong negative impact on the growth rate of strains expressing mutant tRNAs at high level, such expression at low level had little effect on cell fitness. We found that not only codon ambiguity, but also destabilization of the endogenous tRNA pool has a strong negative impact in growth rate. After evolution, strains expressing the mutant tRNA at high level recovered significantly in several growth parameters, showing that these strains adapt and exhibit higher tolerance to codon ambiguity. A fluorescent reporter system allowing the monitoring of Ser misincorporation showed that serine was indeed incorporated and possibly codon reassignment was achieved. Beside the overall negative consequences of codon ambiguity, we demonstrated that codons that tolerate the loss of their cognate tRNA can also tolerate high Ser misincorporation. This raises the hypothesis that these codons can be reassigned to standard and eventually to new amino acids for the production of proteins with novel properties, contributing to the field of synthetic biology and biotechnology.

O código genético é geralmente visto como imutável, no entanto várias alterações à sua forma padrão são conhecidas. Uma das mais notáveis acontece em várias espécies do género Candida, onde o codão Leu-CUG é descodificado como serina por um novo RNA transferência (Ser-tRNACAG). O laboratório de acolhimento fez um grande progresso ao reverter a alteração atípica do código genético do fungo patogénico humano C. albicans, usando uma combinação de tRNAs mutantes, recombinação genética e evolução forçada. Estes resultados levantaram a hipótese que as ambiguidades sintéticas do codão, combinadas com evolução experimental, poderem libertar os codões do seu estado fixo. Nesta tese testamos esta hipótese usando S. cerevisiae como modelo biológico. Geramos ambiguidade em codões específicos, de forma bifásica, envolvendo a deleção de genes de tRNA, seguida pela expressão de tRNAs não-cognatos capazes de compensar o tRNA eliminado. Tendo como base a ideia que os codões raros são mais suscetíveis a alterações que aqueles usados frequentemente, usamos duas estirpes knock-out, nas quais não existem os tRNAs cognatos capazes de descodificar os codões raros CUC-Leu e AGG-Arg. Exploramos então a vulnerabilidade destes codões pela construção de tRNAs mutantes que incorporam erradamente Ser nestes locais. Estas estirpes recombinantes foram evoluídas ao longo do tempo, usando evolução experimental. Apesar de ter havido um forte impacto negativo na taxa de crescimento de estirpes que expressam o tRNA mutante a altos níveis, esta expressão a baixos níveis teve pouco impacto no fitness celular. Descobrimos que não só a ambiguidade do codão, mas também destabilizações da pool de tRNAs endógenos têm um impacto negativo na taxa de crescimento. Após a evolução, as estirpes com elevada expressão do tRNA mutante recuperaram significativamente em vários parâmetros de crescimento, o que mostra que estas adaptam-se e exibem maior tolerância à ambiguidade do codão. Através do sistema repórter fluorescente desenvolvido monitorizamos a incorporação errónea de Ser, o que nos indica que a Ser está de facto a ser incorporada e que, possivelmente, a alteração da identidade do codão foi atingida. Apesar das consequências negativas gerais da ambiguidade do codão, demonstramos que os codões capazes de tolerar a perda do seu tRNA cognato, conseguem também tolerar a incorporação elevada de Ser. Isto levanta a hipótese que estes codões podem ser recodificados para outros aminoácidos naturais e/ou artificiais para a produção de proteínas com novas propriedades, contribuindo assim para o campo da Biologia Sintética e Biotecnologia.