Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/15333
Title: The resistome of Aeromonas salmonicida unraveled by proteomics
Other Titles: O resistoma de Aeromonas salmonicida revelado por proteómica
Author: Osório, Nádia Isabel Almeida
Advisor: Duarte, Ana Sofia Direito dos Santos
Correia, António Carlos Matias
Henriques, Isabel
Keywords: Biologia
Bactérias patogénicas
Aeromonas
Resistência a antibióticos
Beta lactamases
Proteómica
Defense Date: 26-Mar-2014
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Understand the β-lactam response and resistance mechanisms in bacteria is of great value. The increasing failure to treat bacterial infections is maily due to the expression of resistance mechanisms. The aim of this study was to assess the response of Aeromonas salmonicida to β-lactams, mainly ampicillin. We focused on induced and chromosomally located β-lactamases, as well as on the general metabolic changes induced by the presence of the antibiotic, in an attempt to unveil some of the mysteries of the β-lactam “resistome” in this species. Resistance to ampicllin was induced experimentally in A. salmonicida CECT894T (AsWT), creating a derivate ampicillin resistant strain (AsR). First, we evaluated changes that occur at phenotypic level in both strains when challenged by sub inhibitory concentrations of the antibiotic. We found a decrease of growth rate, an increase in expression of inducible β-lactamases and an increase of the ability to form biofilm; these processes must be of major importance for antibiotic stress response. However, the production of virulence factors as haemolysins, proteases and toxins, showed not to be related to the antibiotic challenge but to the initial antibiotic susceptibility phenotype of each strain. Afterwards, in order to get more insights into the physiological changes upon antibiotic stress we compared subproteomes (intra and extracellular) of both strains using two-dimensional gel electrophoresis. The intracellular proteome revealed 119 proteins with changes in abundance and extracellular proteome revealed 53 proteins. Identification of these proteins and the pathways in which they are involved provided a global view of cell metabolism related to antibiotic resistance. We observed as principal changes, an increase in β-lactamase production, a decrease in membrane permeability, overexpression of efflux pumps, a decrease of cell division (growth rate reduction), shifts in metabolism (increase in proteins biosynthesis, in energy production, catabolism of carbohydrates) and an increase in oxidative stress in consequence of an adaptive response to β-lactam antibiotic. In conclusion, we found that A. salmonicida quickly responds to a β-lactam challenge, activating their intrinsic mechanisms of resistance and concurrently producing an adaptive response involving different processes, such as “persister” phenotype (reduced growth), growth in biofilm-mode, SOS response with eventual hypermutation. We also postulate the possible involvement of outer membrane vesicles as a defense mechanism. This work is the first proteomic study of antibiotic challenge in a Aeromonas spp., gaining insights into the β-lactam “resistome”. The identification of the components of this “resistome” is useful for the future development of new therapies.
Compreender a resposta bacteriana a β-lactâmicos e conhecer os mecanismos de resistência envolvidos é de extrema importância para o tratamento de infeções. Cada vez são mais reportadas as falhas no tratamento de infeções, principalmente decorrentes da expressão de mecanismos de resistência bacterianos. Este estudo teve como principal objetivo obter uma visão global da resposta de Aeromonas salmonicida a β-lactâmicos, nomeadamente ampicilina. Focámo-nos nas alterações de expressão das β-lactamases cromossomais indutíveis e nas alterações metabólicas gerais que contribuem para a resistência, numa tentativa de decifrar alguns dos mistérios respeitantes ao “resistoma” desta espécie. Induzimos resistência in vitro para ampicilina em A. salmonicida CECT894T (AsWT) obtendo uma estirpe resistente (AsR). Primeiramente fomos avaliar as mudanças nas características fenotípicas de ambas as estirpes quando desafiadas por concentrações subinibitórias de antibiótico. Encontrámos uma redução na taxa de crescimento, um aumento na expressão de β-lactamases e um aumento na capacidade de formar biofilme mostrando que esses processos detêm extrema importância na resposta à presença do antibiótico. Porém a produção de fatores de virulência como hemolisinas, proteases e toxinas não mostrou estar relacionada diretamente com o desafio de antibiótico, mas sim dependente da suscetibilidade inicial da estirpe. Posteriormente, e a fim de conhecermos melhor os determinantes genéticos e os mecanismos envolvidos nas mudanças fisiológicas que ocorrem durante a adaptação ao antibiótico fomos comparar os subproteomas (intra e extracelular) das duas estirpes por eletroforese em gel bidimensional. Detetámos várias proteínas diferencialmente expressas, 119 a nível intracelular e 53 a nível extracelular. Estas proteínas mostraram-se envolvidas em diferentes vias metabólicas proporcionando uma visão global da resposta celular adaptativa aos β-lactâmicos. Como alterações principais verificámos um aumento na expressão de β-lactamases, uma diminuição na permeabilidade de membrana, uma sobreexpressão de bombas de efluxo, uma diminuição da taxa de divisão celular, alterações metabólicas várias (aumento da síntese de proteínas, produção de energia e catabolismo de hidratos de carbono) e aumento da resposta a stress oxidativo. Em conclusão, A. salmonicida responde rapidamente a β-lactâmicos adaptando os seus mecanismos intrínsecos de resistência e promovendo simultaneamente uma resposta que envolve um fenótipo de "persistência", crescimento bacteriano em biofilme, resposta SOS com eventual hipermutação. Adicionalmente a deteção de β-lactamases no meio extracelular sugere um possível envolvimento de vesículas membranares como mecanismo de defesa. Este estudo torna-se o primeiro a recorrer a proteómica para avaliar a resistência a β-lactâmicos numa espécie de Aeromonas dando indicações preciosas sobre determinantes genéticos relacionados com o “resistoma”, que poderão ser cruciais para o futuro desenvolvimento de novas terapêuticas.
Description: Doutoramento em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/15333
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