Metabolomic study of cellular responses to silk nanoparticles

Abstract

The use of metabolomics to reveal response markers of efficacy or toxicity, as well as to provide biochemical insight into mechanisms of action has gained increasing interest in the research community. In this work, the effects of silk nanoparticles on the metabolism of macrophages, which are an important cell type in regard to NP uptake, was addressed through Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy metabolomics. Firstly, 1D and 2D NMR spectroscopy was applied to determine the metabolic composition of murine macrophages (RAW 264.7 cell line), through the analysis of both aqueous and lipid extracts. Almost forty metabolites were identified, establishing a database of metabolites of murine macrophages. Afterwards, murine macrophages were exposed to two concentrations of silk nanoparticles (10 and 500 μg/mL), selected based on cytotoxicity data collected previously to this work, and the impact on their metabolic composition was assessed. Multivariate analysis was applied to the 1D 1H NMR spectra in order to search the compositional changes in macrophages during silk nanoparticles’ (SNPs) exposure. It was found that the low concentration SNPs induced few changes in the cells metabolome compared to the high concentration SNPs, which resulted in biochemical changes related to energy metabolism and TCA cycle, disturbance of amino acids metabolism and cell membrane modification. Some variations were common to all exposure periods, such as the increase in branched chain amino acids, lactate and tyrosine and the decrease in glutamine, taurine, myo-inositol and ATP/ADP, whereas other variations seemed to be more time-specific. The time-dependent fluctuations were also visible in lipids, where cholesterol, cholesterol esters and sphingomyelin were found to be relatively higher in SNP-exposed samples, while unsaturated fatty acids, plasmalogen and phosphatidylcholine were higher in controls. These results have shown that the use of NMR metabolomics to evaluate a nanomedicine performance may be a powerful tool to improve our understanding of cell-nanomaterial interactions and of the mechanisms underlying observed toxicities.

A aplicação da metabolómica com o intuito de revelar biomarcadores de eficácia ou toxicidade, assim como de fornecer uma compreensão bioquímica de mecanismos de ação, tem ganho maior interesse na comunidade científica. Neste trabalho os efeitos das nanopartículas de seda no metabolismo de macrófagos, que são um tipo celular importante no que diz respeito à incorporação de nanopartículas, foram investigados por metabolómica de espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Inicialmente, espectroscopia de RMN 1D e 2D foi aplicada para determinar a composição metabólica de macrófagos de rato (linha celular RAW 264.7), através da análise de extratos aquosos e lipídicos. Cerca de quarenta metabolitos foram identificados, estabelecendo uma base de dados dos metabolitos de macrófagos de rato. De seguida, esses macrófagos foram expostos a duas concentrações de nanopartículas de seda (10 e 500 μg/mL), selecionadas com base nos dados citotoxicológicos recolhidos previamente a este trabalho, e o seu impacto no metabolismo foi averiguado usando a mesma metodologia. Análise multivariada foi aplicada aos espectros de 1H RMN 1D de forma a investigar as alterações na composição dos macrófagos durante a exposição às nanopartículas de seda (SNPs). A concentração baixa de SNPs induziu poucas alterações no metaboloma celular comparativamente à concentração alta de SNPs, que resultou em alterações bioquímicas no metabolismo energético e ciclo do ácido cítrico, distúrbios no metabolismo de aminoácidos e modificações na membrana celular. Algumas variações foram comuns a todos os períodos de exposição, tais como o aumento dos aminoácidos de cadeia ramificada, lactato e tirosina, e a diminuição de glutamina, taurina, myo-inositol e ATP/ADP, enquanto que outras se revelaram ser mais específicas em relação ao tempo de exposição. As flutuações dependentes do tempo foram também visíveis nos lípidos, onde o colesterol, ésteres de colesterol e esfingomielina se encontraram mais elevados nas amostras expostas à concentração elevada de SNPs, enquanto que os ácidos gordos insaturados, plasmalogénio e fosfatidilcolina estavam mais elevados nos controlos. Estes resultados demonstraram que a aplicação de metabolómica de RMN para avaliar o desempenho de nanofármacos pode ser uma ferramenta importante para melhorar a nossa compreensão das interações célula-nanomaterial e os mecanismos subjacentes à toxicidade observada.