Development of infrared spectroscopy for assessing bacterial quality in foods

Abstract

Rapid and specific detection of foodborne bacteria that can cause food spoilage or illness associated to its consumption is an increasingly important task in food industry. Bacterial detection, identification, and classification are generally performed using traditional methods based on biochemical or serological tests and the molecular methods based on DNA or RNA fingerprints. However, these methodologies are expensive, time consuming and laborious. Infrared spectroscopy is a reliable, rapid, and economic technique which could be explored as a tool for bacterial analysis in the food industry. In this thesis it was evaluated the potential of IR spectroscopy to study the bacterial quality of foods. In Chapter 2, it was developed a calibration model that successfully allowed to predict the bacterial concentration of naturally contaminated cooked ham samples kept at refrigeration temperature during 8 days. In this part, it was developed the methodology that allowed the best reproducibility of spectra from bacteria colonies with minimal sample preparation, which was used in the subsequent work. Several attempts trying different resolutions and number of scans in the IR were made. A spectral resolution of 4 cm-1, with 32 scans were the settings that allowed the best results. Subsequently, in Chapter 3, it was made an attempt to identify 22 different foodborne bacterial genera/species using IR spectroscopy coupled with multivariate analysis. The principal component analysis, used as an exploratory technique, allowed to form distinct groups, each one corresponding to a different genus, in most of the cases. Then, a hierarchical cluster analysis was performed to further analyse the group formation and the possibility of distinction between species of the same bacterial genus. It was observed that IR spectroscopy not only is suitable to the distinction of the different genera, but also to differentiate species of the same genus, with the simultaneous use of principal component analysis and cluster analysis techniques. The utilization of IR spectroscopy and multivariate statistical analysis were also investigated in Chapter 4, in order to confirm the presence of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. isolated from contaminated foods, after growth in selective medium. This would allow to substitute the traditional biochemical and serological methods that are used to confirm these pathogens and that delay the obtainment of the results up to 2 days. The obtained results allowed the distinction of 3 different Listeria species and the distinction of Salmonella spp. from other bacteria that can be mistaken with them. Finally, in chapter 5, high pressure processing, an emerging methodology that permits to produce microbiologically safe foods and extend their shelf-life, was applied to 12 foodborne bacteria to determine their resistance and the effects of pressure in cells. A treatment of 300 MPa, during 15 minutes at room temperature was applied. Gram-negative bacteria were inactivated to undetectable levels and Gram-positive showed different resistances. Bacillus cereus and Staphylococcus aureus decreased only 2 logs and Listeria innocua decreased about 5 logs. IR spectroscopy was performed in bacterial colonies before and after HPP in order to investigate the alterations of the cellular compounds. It was found that high pressure alters bands assigned to some cellular components as proteins, lipids, oligopolysaccharides, phosphate groups from the cell wall and nucleic acids, suggesting disruption of the cell envelopes. In this work, bacterial quantification and classification, as well as assessment of cellular compounds modification with high pressure processing were successfully performed. Taking this into account, it was showed that IR spectroscopy is a very promising technique to analyse bacteria in a simple and inexpensive manner.

A deteção rápida e específica de bactérias que podem provocar deterioração de alimentos ou doenças associadas ao seu consumo é cada vez mais importante na indústria alimentar. A deteção, identificação e classificação de bactérias são geralmente realizadas utilizando métodos tradicionais baseados em testes bioquímicos e/ou serológicos e em métodos moleculares baseados em análise de DNA ou RNA. Contudo, estas metodologias são dispendiosas, demoradas e trabalhosas. A espectroscopia de infravermelho é uma técnica confiável, rápida e económica, que pode ser explorada como ferramenta para a indústria alimentar. Nesta tese foi avaliado o potencial da espectroscopia de infravermelho para estudar a qualidade bacteriana de alimentos. No capítulo 2, foi desenvolvido um modelo de calibração que permitiu prever com sucesso a concentração bacteriana de fiambre naturalmente contaminado, mantido em refrigeração durante 8 dias. Nesta parte, foi desenvolvida a metodologia que permitiu obter a melhor reprodutibilidade dos espectros das colónias de bactérias, com preparação mínima das amostras, que foi utilizada no trabalho subsequente. Foram realizadas várias tentativas para a obtenção de espectros de infravermelho, testando diferentes resoluções e número de scans. Os melhores resultados foram obtidos utilizando uma resolução espectral de 4 cm-1 e 32 varrimentos. De seguida, no capítulo 3, foi feita uma tentativa de identificar 22 bactérias provenientes de alimentos usando a espectroscopia de infravermelho associada a análise multivariada. A análise de componentes principais, utilizada como método exploratório, permitiu a formação de grupos distintos, cada um correspondendo a um género diferente, na grande maioria dos casos. Posteriormente, foi realizada uma análise hierárquica por clusters de forma a investigar a formação de grupos e a possibilidade de distinção de espécies dentro de um mesmo género de bactérias. Observou-se que a espectroscopia de infravermelho é adequada não só para a distinção de diferentes géneros, mas também para diferenciar espécies dentro de um mesmo género, com o uso simultâneo de análise de componentes principais e análise hierárquica por clusters. A utilização de espectroscopia de infravermelho e análise estatística multivariada foram também investigadas no capítulo 4 para confirmação da presença de Listeria monocytogenes e Salmonella spp., isoladas a partir de alimentos contaminados, após crescimento em meio selectivo. Isto permitiria a substituição dos métodos bioquímicos e serológicos que são usados para confirmar a presença destas bactérias patogénicas e que podem atrasar a obtenção de resultados por 2 dias. Os resultados obtidos permitiram a distinção de Salmonella spp. de outras bactérias que se possam confundir com elas. Por fim, no capítulo 5, o processamento por alta pressão, uma metodologia emergente que permite produzir alimentos microbiologicamente seguros e aumentar o seu tempo de prateleira, foi aplicada a 12 bactérias alimentares, de forma a determinar a sua resistência e os efeitos da pressão a nível das células. Foi aplicado um tratamento de 300 MPa, à temperatura ambiente e durante 15 minutos. As bactérias de Gram-negativo foram inativadas até níveis não detetáveis, enquanto as de Gram-positivo mostraram diferentes níveis de resistência. As espécies Bacillus cereus e Staphyloccus aureus decresceram apenas 2 unidades logarítmicas enquanto a espécie Listeria innocua diminuiu cerca de 5 unidades logarítmicas. A espectroscopia de infravermelho foi utilizada na análise das colónias bacterianas antes e após o tratamento por alta pressão, de forma a investigar as alterações que são provocadas nos componentes celulares com este tipo de processamento. Descobriu-se que a alta pressão altera bandas espectrais correspondentes a alguns componentes celulares, de entre os quais proteínas, lípidos, oligopolissacarídeos, grupos fosfato da parede celular e ácidos nucleicos, podendo indicar rutura da parede/membrana celular. Neste trabalho, a quantificação de bactérias e a sua classificação, bem como a análise de modificação nos componentes celulares após processamento por alta pressão foram realizados com sucesso. Assim, a espectroscopia de infravermelho demonstrou ser uma técnica bastante promissora para analisar bactérias provenientes de alimentos de uma forma simples e pouco dispendiosa.