Caracterização genotípica e molecular de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa resistentes a quinolonas

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative pathogen associated with a number of nosocomial infections. The preoccupying increase of quinolone resistant P. aeruginosa was the basis for the present study. Thirty five quinolone resistant P. aeruginosa strains were obtained from the pathology service of Hospital Infante D. Pedro, Aveiro. Firstly, the 35 isolates were typed using molecular methods. Those methods consisted in ribossomal restriction of amplified DNA (ARDRA), Box-PCR and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE). The results obtained revealed that the patients were already colonized by more than one genotype on admission suggesting a rapid dissemination of P. aeruginosa outside the hospital environment. PFGE revealed a high degree of heterogeneity between isolates. The results obtained suggested that cross contamination is an important route for P. aeruginosa acquisition. Type II topoisomerase (DNA gyrase and Topoisomerase IV) are the targets of quinolones. Mutations in the genes coding for these enzymes (gyrA, gyrB, parC and parE) were also studied. The results revealed the presence of mutations in 16 of the 35 strains. Some of the mutations found are new and have never been described before in P. aeruginosa. Those mutations were identified in the QRDR of gyrB gene, (codon 465) in the QRDR of parC gene (codon 35) and also in the parE gene (codon 431, 483, 487, 530, 538 and 544) Given the genetic background of the isolates, expression of the genes coding for membrane proteins involved in the efflux systems was also analysed. RT PCR showed that strain Pa31 was down regulated to mex B, mex F and mexY. A growth experiment was carried out on some strains showing QRDR mutations revealing that strain Pa31 shows a slower growth rate when compared to others. This is likely to have an impact on it’s in vivo fitness in antibiotic free medium.

Pseudomonas aeruginosa é um organismo patogénico, de Gram-negativo, frequentemente associado a infecções nosocomiais. O preocupante aumento de estirpes de P. aeruginosa resistentes a quinolonas constituíu a base para o presente trabalho. Assim, estudaram-se trinta e cinco isolados de P. aeruginosa resistentes a quinolonas, obtidos pelo serviço de patologia do Hospital Infante D. Pedro, Aveiro. Numa primeira fase do trabalho procedeu-se à tipagem molecular dos isolados, os quais foram comparados por análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA), por BOX-PCR e por electroforese em campo pulsado (PFGE). Os resultados obtidos mostraram que os pacientes já se encontravam colonizados por mais do que um genótipo aquando da colheita, sugerindo uma elevada disseminação de P. aeruginosa fora do ambiente hospitalar. Por PFGE verificou-se também uma grande heterogeneidade entre os isolados. Assim, os resultados obtidos mostraram que a contaminação cruzada é uma importante via para aquisição de P. aeruginosa. Os alvos das quinolonas são as topoisomerases do tipo II (DNA girase e topoisomerase IV). O aparecimento de mutações nos genes que codificam estas enzimas (gyrA, gyrB, parC and parE) foi averiguado. Os resultados revelaram a presença de algumas mutações novas em 16 dos isolados. Estas, foram identificadas na QRDR dos genes gyrB (codão 465), gene parC (codão 35) e gene parE (codões 431, 483, 487, 530, 538 e 544). Nenhuma das mutações foi anteriormente descrita em P. aeruginosa. Dado o background genético dos isolados foi também estudada a expressão dos genes cujos produtos são intervenientes dos sistemas de efluxo. Por RTPCR verificou-se que a estirpe Pa31 não expressava os genes mex B, mex F e mexY. Este resultado conduziu a um estudo de crescimento, que mostrou tratar-se de um isolado com um crescimento mais lento do que os restantes o que possivelmente terá um impacto no “fitness” in vivo em meio de cultura sem antibiótico.