Interação da proteína Blad do tremoço com a membrana plasmática da Candida albicans

Abstract

O objetivo principal do trabalho foi identificar os alvos potenciais de ligação do polipéptido Blad na membrana plasmática de Candida albicans que permitam elucidar o mecanismo de ação do polipéptido Blad responsável pela sua potente atividade fungicida. O polipéptido Blad é um antifúngico obtido a partir do tremoço de eficácia igual, ou superior, à dos fungicidas de síntese química existentes no mercado. O polipéptido Blad é um produto intermediário estável do catabolismo da β-conglutina, sendo um polipéptido de 20 kDa, composto por 173 aminoácidos, não glicosilado mas fosforilado e faz parte de uma proteína de 210 kDa. Estudos anteriores efetuados com o fungo patogénico modelo, Candida albicans, revelaram que interfere com a estabilidade da membrana plasmática causando disrupção e inatividade metabólica. Por outro lado, ligando-se a estruturas glicosiladas também foi demonstrado que o polipéptido Blad possui atividade de lectina. Com base nisto, testou-se a hipótese do polipéptido Blad se ligar às proteínas glicosiladas da membrana plasmática de C. albicans, e deste modo desencadear um evento molecular/celular na membrana que leve à morte da célula. Na totalidade dos ensaios de imunodeteção do polipéptido Blad na sua ligação às proteínas da membrana plasmática de C. albicans, verificou-se que este se liga a 9 proteínas com massa molecular aproximada de 75 kDa, 50 kDa, 37 kDa (2), 25 kDa (2), 20 kDa, 15 kDa e 10 kDa. No ensaio de imunodetecção do polipéptido Blad, em que as proteínas da membrana plasmática de C. albicans foram desglicosiladas, parece existir alguma evidência que reforça a assunção do polipéptido Blad possuir atividade de lectina. Após ensaio de imunodeteção do polipéptido Blad ligado a proteínas da membrana plasmática de C. albicans, estas foram isoladas e foram identificadas por espectrometria de massa. As proteínas identificadas com possível afinidade de ligação ao polipéptido Blad foram a enolase 1, alcoól desidrogenase 1 e a subunidade beta da ATP sintetase, que são proteínas descritas na literatura como associadas à membrana plasmática de C. albicans, sendo que a sua função nesta localização celular é desconhecida. Não foi possível realizar a análise das glicanas das proteínas associadas à membrana plasmática de C. albicans com afinidade de ligação ao polipéptido Blad, que foram identificadas neste trabalho, devido a limitações experimentais. Devido às limitações dos procedimentos utilizados neste trabalho, deve-se continuar a tentar, através de procedimentos mais sofisticados, a identificação de potenciais alvos de ligação do polipéptido Blad na membrana plasmática de Candida albicans que permitam elucidar o mecanismo de

The main objective of this work was the identification of potential targets for the polypeptide Blad in the plasma membranes of Candida albicans cells. This knowledge will be a step forward in the elucidation of Blad polypeptide mode of action responsible for it powerful fungicide activity. Blad polypeptide is a fungicide obtained from lupin and has fungicide potency under agricultural conditions equal or greater than that of their chemical counterparts. Blad polypeptide is a stable intermediate of β-conglutin catabolism, with 20 kDa, composed of 173 amino acids, non-glycosylated but phosphorylated and it is part of a protein of 210 kDa. Previous studies performed with the model fungal pathogen, Candida albicans, revealed that Blad interferes with the fungus plasma membrane stability causing disruption and metabolic inactivity. In addition, binding to glycosylated structures it was also demonstrated that Blad polypeptide has lectin activity. Based on these two findings, in this work the hypothesis that Blad polypeptide binds to glycosilated proteins of the plasma membrane, unleashing a molecular/cellular event leading to cell death, was tested. In the immunodetection assays of Blad polypeptide to its binding to the plasma membrane proteins of C. albicans it was found that it binds to nine proteins of approximate molecular mass of 75 kDa, 50 kDa, 37 kDa (2), two of 25 kDa (2), 20 kDa, 15 kDa and 10 kDa. In the immunodetection assay of Blad polypeptide, in which the plasma membrane proteins of C. albicans were deglycosylated, there appears to be some evidence that strengthens the assumption of lectin activity of Blad polypeptide. After immunodetection assay of Blad polypeptide bound to the plasma membrane proteins of C. albicans, these have been isolated and identified by mass spectrometry. The proteins identified with possible binding affinity to Blad polypeptide were enolase 1, alcohol dehydrogenase 1 and the beta subunit of ATP synthase, which are proteins described in literature as being associated with the plasma membrane of C. albicans, although its function in this cellular location is still unknown. It was not possible to perform the analysis of glycans of the proteins associated with the plasma membrane of C. albicans with binding affinity to Blad polypeptide, which were identified in this work, due to experimental limitations. Due to the limitations of the procedures used in this work it’s important to continue to attempt, through more sophisticated procedures, the identification of potential binding targets of Blad polypeptide in the plasma membrane of C. albicans, allowing to elucidate the mechanism of action responsible for its potent fungicide activity.