Alternative polyadenylation of Rho GTPases : a gene/cell specific process

Abstract

Alternative polyadenylation (APA) is an important mechanism of gene regulation that occurs in 70% of eukaryotic organisms. This process comprises the formation of alternative 3’ ends of an mRNA by cleavage of the pre-mRNA and polyadenylation at different sites according to the polyadenylation signals (pAs). The choice of pAs in APA is a co-transcriptional mechanism that depends on auxiliary cis- and trans-acting factors. The usage of the proximal or the distal pAs has been related to global physiologic events. It is consensually assumed that in proliferative conditions there is preferential usage of proximal pAs, while during development and in differentiated cellular states occurs lengthening of the 3’UTRs by selection of the distal pAs. This pattern is also confirmed in brain tissues, where most of the cells are differentiated, and where it was observed a lengthening of the 3’ UTRs. However, there is not a complete switch for the distal pA, since the shortest mRNA is still expressed. Rho GTPases are key molecular switchers essential for several cellular processes, including differentiation, however nothing is known about transcriptional regulation in these genes. Therefore, we started to explore if Rho GTPases genes undergo APA. We found by 3’RACE analyses, that classical Rho GTPAses express two alternative mRNA isoforms. However during oligodendrocytes differentiation, they preferentially express the shortest mRNA isoform, and we did not observe a switch towards the distal pA usage, in contrast with the published genome-wide data obtained from brain tissues. Since Rho GTPases are tightly regulated at the protein level by GEFs and GAPs, they may not require this mode of co-transcriptional regulation. The atypical RhoBTB2, which is constitutively active, present a global induction of distal pA sites, distinct from the classical Rho GTPases. Interestingly, this pattern suggests that APA is a gene specific mechanism. As longer 3'UTRs contain more binding sites for miRNAs and RNA binding proteins (RBPs) this suggests that atypical Rho GTPases require a fine-tune regulation at the co-transcriptional level, by APA. Additionally, we showed that APA is also cell-specific, by analyzing the expression of the different mRNA isoforms of Rho GTPases in other glial cells (microglia, astrocytes) and different types of neurons (cortical, striatal and hippocampal). We observed the same APA profile for the selected Rho GTPases in all glial cells types. However, in cortical and striatal neurons we observed a lengthening in the 3’UTR Rac1 mRNA during axonal growth, which results in the increase of the total protein levels. Taken together, our results indicate for the first time that APA is a gene- and cell- specific mechanism. In addition, we have found a differential expression of both Cdc42 isoforms during OL and sciatic nerve differentiation. During in vitro OL and in vivo sciatic nerve differentiation we observed an increase in the expression ratio between Cdc42 Iso1/Cdc42 Iso2. Further, constitutive expression of Cdc42 Iso2 in OLs induces a delay in differentiation, whereas constitutive expression of Cdc42 Iso1 induces an increase in OL branching, suggesting an exacerbation of the differentiated phenotype. Thus, these observations suggest a distinct role for the different Cdc42 isoforms during OL differentiation. Overall, this thesis opens new avenues to explore in the future that can impact our understanding on the regulation of the myelination/remyelination processes.

A poliadenilação alternativa (APA) é um mecanismo importante de regulação genética que ocorre em 70% dos organismos eucariotas. Este mecanismo compreende a formação de extremidades 3’ alternativas por poliadenilação em diferentes locais do mRNA, de acordo com os sinais de poliadenilação (pAs). Na APA, a escolha dos pAs é um mecanismo co-transcripcional que depende de factores auxiliares cis e trans necessários para os processos de clivagem e poliadenilação de todos os pré-mRNAs. Além disso, o uso dos pAs proximais ou distais está relacionado com eventos fisiológicos gerais. Consensualmente assume-se que em estados de proliferação ocorre o encurtamento, enquanto em estados de desenvolvimento e diferenciação ocorre o alongamento das extremidades 3’ não traduzidas (3’UTRs). Este padrão de APA é confirmado em tecidos cerebrais, onde a maior parte das células são diferenciadas, no entanto não existe uma alteração completa para a isoforma de mRNA longa uma vez que a isoforma curta continua a ser expressa. As Rho GTPases são ‘interruptores’ moleculares essenciais a vários processos celulares, incluindo a diferenciação, no entanto nada é conhecido sobre a sua regulação transcripcional. Assim, começamos a explorar se estes genes são regulados por APA. Descobrimos por análise de 3´RACE que, as Rho GTPases clássicas, expressam duas formas alternativas de mRNA. Contudo durante a diferenciação dos oligodendrócitos (OLs), eles expressam preferencialmente a isoforma mRNA mais curta, e não se observou uma alteração para a escolha da isoforma mais longa, em contraste com os dados de estudos globais do genoma em tecido cerebral. Uma vez que estas proteínas são altamente reguladas por GEFs e por GAPs, provavelmente não necessitam de regulação a nível transcripcional. As Rho GTPases atípicas, que estão constitutivamente activas, apresentam um indução global dos pAs distais, distintas das Rho GTPases clássicas. Curiosamente, este padrão sugere que APA é um mecanismo específico do gene. Como 3’UTRs mais longas providenciam mais locais de ligação para microRNA ou proteínas de ligação ao RNA (RBPs), isto sugere que as Rho GTPases atípicas requerem uma regulação mais fina ao nível co-transcriptional, por APA. Adicionalmente, mostramos que a APA é também específica de cada tipo celular, pela análise da expressão do mRNA em outras células da glia (microglia, astrócitos), e em diferentes tipos de neurónios (corticais, estriatais e hipocampais). Nós observamos o mesmo padrão de APA para as Rho GTPases selecionadas em todas as células da glia. No entanto, em neurónios corticais e do estriado, observámos a existência do alongamento do 3’UTR no mRNA da Rac1 durante o crescimento axonal, o que resulta num aumento da quantidade total de proteína. Em resumo, estes resultados indicam, pela primeira vez, que a APA é um mecanismo específico de cada gene e de cada tipo celular. Para além disso, descobrimos uma expressão diferencial de ambas as isoformas da Cdc42 durante a diferenciação dos OLs e do nervo ciático. Durante a diferenciação in vitro de OLs e in vivo do nervo ciático, observámos um aumento do rácio da expressão entre Cdc42 Iso1/Cdc42 Iso2. Mais ainda, a expressão constitutiva de Cdc42 Iso2 em OLs induz um atraso na diferenciação, enquanto a expressão constitutiva da Cdc42 Iso1 induz um aumento das ramificações, sugerindo uma exacerbação do fenótipo de diferenciação. Assim, estas observações sugerem um papel distinto para as diferentes isoformas de Cdc42 durante a diferenciação de OLs. Globalmente, esta tese abre novos caminhos para explorar no futuro, que podem ter um impacto no nosso conhecimento, na regulação do processo de mielinização/remielinização.