Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/14784
Title: Healthy pregnancy and prenatal disorders followed by blood plasma metabolomics
Other Titles: Gravidez saudável e doenças pré-natais estudadas por metabolómica de plasma sanguíneo
Author: Pinto, Joana Isabel Monteiro
Advisor: Gil, Ana Maria Pissarra Coelho
Domingues, Maria do Rosário
Keywords: Bioquímica
Plasma sanguíneo
Gravidez
Diagnóstico pré-natal
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear
Defense Date: 2015
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: The work presented in this thesis aimed to investigate the impact of healthy pregnancy and selected prenatal disorders on the metabolome and lipidome of maternal blood plasma, in order to define new potential biomarkers for non-invasive prediction and diagnosis. Chapter 1 describes the present status and challenges of the clinically relevant prenatal disorders, along with a presentation of the metabolomics strategy applied and the state of the art of metabolomics in prenatal research. All experimental details are described in Chapter 2, comprising sample metadata, sample collection and preparation, data acquisition protocols and data analysis procedures. The plasma metabolome and lipidome viewed by 1D and 2D NMR experiments are presented in Chapter 3. In this chapter, the use of Multiple Quantum NMR spectroscopy was explored, for the first time, for assignment of complex lipid mixtures. Chapter 4 contributes to filling in some existing gaps regarding human plasma degradability during handling and storage, as well as the importance of fasting conditions at collection. The use of heparin collection tubes resulted in no interference of the polysaccharide and full conservation of spectral information, while EDTA tubes produced a number of interfering signals from free and Ca2+/Mg2+ complexed EDTA, the impact of which on metabolomic analysis is discussed. Regarding temperature stability, large changes in lipoproteins and choline compounds were observed in plasma kept at room temperature for  2.5 hours, whereas short-term storage at -20ºC was found suitable up to 7 days, with storage at -80ºC being recommended, particularly for long-term periods (at least up to 2.5 years). Regarding freeze-thaw cycles, no more than 3 consecutive cycles were found advisable, while the use of non-fasting conditions (instead of fasting) was found acceptable. Chapter 5 presents the first NMR metabolomics study of maternal plasma throughout pregnancy, including correlation between plasma and urine metabolites. Some of the metabolic alterations observed confirmed known metabolic effects, while novel changes were observed, suggesting adjustments in energy and gut microflora metabolisms (citrate, lactate and dimethyl sulfone) and alterations in glomerular filtration rate (creatine and creatinine). Correlations studies unveiled specific lipoprotein/protein metabolic aspects of healthy pregnancy with impact on the excreted metabolome, providing further understanding of pregnancy metabolism. In Chapter 6, the impact of prenatal disorders on maternal plasma metabolome and lipidome is described for fetal chromosomal disorders (CD), including Trisomy 21 (T21). High classification rates were obtained for CD (88-89%) and T21 (85-92%) in 1st and 2nd trimesters, based on variable selection of NMR data. In addition, novel metabolic deviations were found through plasma/urine correlations, namely in low density and very low density lipoproteins (LDL+VLDL), sugar and gut microflora metabolisms. Changes in plasma phospholipid profile, namely in phosphatidylcholines, were further confirmed and characterised by hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry (HILIC-LC/MS). In Chapter 7, metabolic biomarkers of pre- and post-diagnosis GDM were sought by NMR metabolomics of whole maternal plasma and plasma lipid profile in the 2nd trimester. Metabolic alterations found to be predictive of GDM comprised increases in cholesterol, fatty acids, triglycerides and small metabolites changes in glucose, amino acids, betaine, urea, creatine and metabolites related with gut microflora. Post-diagnosis GDM was successfully classified using a 26-resonance plasma biomarker corresponding to 10 metabolites and lipids, advancing the possibility of using a multi-metabolite biomarker as a complementary tool in the clinical management of GDM. Chapter 8 describes the results obtained for prenatal disorders shown to have lower impact on maternal plasma metabolome, namely diagnosed fetal malformations and pre-diagnosis premature rupture of membranes, preterm delivery and preeclampsia. Finally, Chapter 9 describes the general conclusions and future perspectives in the context of this thesis, highlighting how this work contributes with new knowledge on prenatal disease mechanisms and possible biomarkers for prenatal diagnosis and prediction methods.
O trabalho apresentado nesta tese teve como principal objetivo investigar o impacto da gravidez saudável e algumas doenças pré-natais no metaboloma e lipidoma de plasma sanguíneo materno, com vista à definição de novos biomarcadores para a previsão e diagnóstico não invasivos daquelas doenças. O Capítulo 1 descreve a perspectiva atual e os desafios das doenças pré-natais mais relevantes, assim como a estratégia metabolómica e estado da arte na investigação pré-natal. Todos os detalhes experimentais do trabalho realizado estão descritos no Capítulo 2, incluindo as condições de amostragem, recolha e preparação das amostras, bem como os protocolos de aquisição e análise dos dados. No Capítulo 3 descreve-se o metaboloma e lipidoma de plasma detectados por RMN 1D e 2D. Neste capítulo, a utilização de espectroscopia de RMN de quantum-múltiplo foi explorada, pela primeira vez, para caracterização de misturas lipídicas complexas. O Capítulo 4 contribui para colmatar algumas falhas no conhecimento sobre a degradibilidade do plasma humano durante o manuseamento da amostra e armazenamento, e a importância de condições de colheita como o jejum. A utilização de tubos de colheita com heparina não mostrou interferência do polissacarídeo nos espectros conservando-se toda a informação espectral, enquanto que os tubos com EDTA deram origem a sinais interferentes provenientes do EDTA livre e complexado com Ca2+/Mg2+, cujo impacto na análise metabolómica é discutido. Relativamente à estabilidade do plasma à temperatura ambiente, foram observadas alterações nas lipoproteínas e compostos de colina a partir de 2.5 horas, enquanto que o armazenamento a -20ºC mostrou ser adequado até 7 dias, sendo o armazenamento a -80ºC aconselhado, particularmente para períodos de tempo longos (pelo menos até 2.5 anos). Relativamente aos ciclos de congelação-descongelação, não se aconselham mais de 3 ciclos consecutivos, enquanto que o efeito da colheita das amostras em não-jejum (em vez de jejum) foi considerado aceitável. O Capítulo 5 apresenta o primeiro estudo de metabolómica por RMN do plasma materno ao longo da gravidez, incluindo correlação entre plasma e urina. Algumas das alterações metabólicas observadas confirmaram efeitos metabólicos conhecidos, tendo outras sido observadas pela primeira vez sugerindo alterações no metabolismo energético, na microflora bacteriana (citrato, lactato e dimetil sulfona) e na taxa de filtração glomerular (creatina e creatinina). Os estudos de correlação revelaram aspetos metabólicos específicos das lipoproteínas/proteínas com impacto no metaboloma excretado. No Capítulo 6 descreve-se o impacto das doenças cromossómicas (CD), incluindo Trissomia 21 (T21) no metaboloma e lipidoma de plasma materno. Obtiveram-se elevadas taxas de classificação para CD (88-89%) e T21 (85-92%) no 1º e 2º trimestres baseadas na seleção de variáveis dos dados de RMN. A correlação de plasma e urina revelou novos desvios metabólicos, nomeadamente no metabolismo das lipoproteínas de baixa densidade e de muito baixa densidade (LDL+VLDL), dos açúcares e da microflora bacteriana. As alterações observadas no perfil de fosfolípidos do plasma, nomeadamente das fosfatidilcolinas, foram confirmadas e caracterizadas por cromatografia liquida hidrofílica acoplada a espetrometria de massa (HILIC-LC/MS). No Capítulo 7 apresentam-se os resultados obtidos na prospecção de biomarcadores metabólicos de diabetes mellitus gestacional (GDM) pré- e pós-diagnóstico por metabolómica de RMN de plasma materno do 2º trimestre. Observaram-se alterações metabólicas com poder de previsão de GDM, nomeadamente um aumento no colesterol, ácidos gordos, triglicerídeos e pequenas variações metabólicas na glucose, aminoácidos, betaína, ureia, creatina e metabolitos relacionados com a microflora bacteriana. O grupo de GDM pós-diagnóstico foi bem classificado utilizando como biomarcador um conjunto de 26 ressonâncias do espectro de plasma correspondendo a lípidos e 10 metabolitos de baixo peso molecular, sugerindo-se a possibilidade de usar este marcador conjunto na gestão clínica da GDM. O Capítulo 8 descreve os resultados obtidos para as doenças pré-natais que mostraram ter um menor impacto no metaboloma de plasma materno, nomeadamente as malformações fetais (FM), e os estados de pré-diagnóstico da rutura prematura das membranas (PROM), parto pré-termo (PTD) e pré-eclampsia. Finalmente, no Capítulo 9 são descritas as conclusões gerais e perspetivas futuras no contexto desta tese, realçando-se como este trabalho contribui para o novo conhecimento dos mecanismos das doenças pré-natais e possíveis biomarcadores para a sua previsão e diagnóstico.
Description: Doutoramento em Bioquímica
URI: http://hdl.handle.net/10773/14784
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