Evaluation of the matabolic response of osteosarcoma cells to conventional and new anticancer drugs by NMR metabolomics

Abstract

The main scope of this work was to evaluate the metabolic effects of anticancer agents (three conventional and one new) in osteosarcoma (OS) cells and osteoblasts, by measuring alterations in the metabolic profile of cells by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy metabolomics. Chapter 1 gives a theoretical framework of this work, beginning with the main metabolic characteristics that globally describe cancer as well as the families and mechanisms of action of drugs used in chemotherapy. The drugs used nowadays to treat OS are also presented, together with the Palladium(II) complex with spermine, Pd2Spm, potentially active against cancer. Then, the global strategy for cell metabolomics is explained and the state of the art of metabolomic studies that analyze the effect of anticancer agents in cells is presented. In Chapter 2, the fundamentals of the analytical techniques used in this work, namely for biological assays, NMR spectroscopy and multivariate and statistical analysis of the results are described. A detailed description of the experimental procedures adopted throughout this work is given in Chapter 3. The biological and analytical reproducibility of the metabolic profile of MG-63 cells by high resolution magic angle spinning (HRMAS) NMR is evaluated in Chapter 4. The metabolic impact of several factors (cellular integrity, spinning rate, temperature, time and acquisition parameters) on the 1H HRMAS NMR spectral profile and quality is analysed, enabling the definition of the best acquisition parameters for further experiments. The metabolic consequences of increasing number of passages in MG-63 cells as well as the duration of storage are also investigated. Chapter 5 describes the metabolic impact of drugs conventionally used in OS chemotherapy, through NMR metabolomics studies of lysed cells and aqueous extracts analysis. The results show that MG-63 cells treated with cisplatin (cDDP) undergo a strong up-regulation of lipid contents, alterations in phospholipid constituents (choline compounds) and biomarkers of DNA degradation, all associated with cell death by apoptosis. Cells exposed to doxorubicin (DOX) or methotrexate (MTX) showed much slighter metabolic changes, without any relevant alteration in lipid contents. However, metabolic changes associated with altered Krebs cycle, oxidative stress and nucleotides metabolism were detected and were tentatively interpreted at the light of the known mechanisms of action of these drugs. The metabolic impact of the exposure of MG-63 cells and osteoblasts to cDDP and the Pd2Spm complex is described in Chapter 6. Results show that, despite the ability of the two agents to bind DNA, the metabolic consequences that arise from exposure to them are distinct, namely in what concerns to variation in lipid contents (absent for Pd2Spm). Apoptosis detection assays showed that, differently from what was seen for MG-63 cells treated with cDDP, the decreased number of living cells upon exposure to Pd2Spm was not due to cell death by apoptosis or necrosis. Moreover, the latter agent induces more marked alterations in osteoblasts than in cancer cells, while the opposite seemed to occur upon cDDP exposure. Nevertheless, the results from MG-63 cells exposure to combination regimens with cDDP- or Pd2Spm-based cocktails, described in Chapter 7, revealed that, in combination, the two agents induce similar metabolic responses, arising from synergy mechanisms between the tested drugs. Finally, the main conclusions of this thesis are summarized in Chapter 8, and future perspectives in the light of this work are presented.

Este trabalho teve como principal objetivo estudar os efeitos metabólicos de alguns fármacos (três fármacos convencionais e um em desenvolvimento) em células de osteossarcoma (OS) e osteoblastos, através da medição de alterações dos perfis metabólicos celulares por metabolómica usando espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). O Capítulo 1 apresenta um enquadramento teórico deste trabalho, começando por identificar as principais características metabólicas que descrevem o cancro em geral, assim como as famílias e mecanismos de ação dos fármacos usados no seu tratamento. São ainda apresentados os fármacos usados atualmente na quimioterapia do OS, bem como o complexo de Paládio (II) com espermina, Pd2Spm, com potencial atividade anticancerígena. Seguidamente, é explicada a estratégia da metabolómica celular e apresentado o estado da arte de estudos metabolómicos do efeito de agentes anticancerígenos em células. No Capítulo 2, apresentam-se os princípios das técnicas analíticas usadas neste trabalho, nomeadamente ensaios biológicos, espectroscopia de RMN e análise multivariada e estatística dos resultados. Os detalhes e procedimentos experimentais relativos aos métodos usados são descritos no Capítulo 3. O estudo da reprodutibilidade analítica e biológica do perfil metabólico de células MG-63 medido por RMN de alta resolução e rotação segundo o ângulo mágico (HRMAS) é apresentado no Capítulo 4. Avalia-se o impacto de vários fatores (integridade celular, velocidade de rotação da amostra, temperatura, duração e parâmetros de aquisição) nas características e qualidade do espectro de RMN HRMAS de 1H, definindo-se então os parâmetros de aquisição dos espectros a adquirir subsequentemente. Avaliam-se também os efeitos do nº de passagens celulares e do tempo de armazenamento no perfil metabólico de células MG-63. O Capítulo 5 descreve o impacto metabólico de fármacos convencionais usados atualmente na quimioterapia do OS, estudado por metabolómica por RMN de células lisadas e análise de extratos celulares aquosos. Os resultados mostram que as células MG-63 tratadas com cisplatina (cDDP) sofrem um aumento dramático do teor de lípidos, alterações dos níveis de constituintes dos fosfolípidos (compostos de colina) e de indicadores de degradação do DNA, associados a fenómenos de apoptose. Nas células expostas a doxorrubicina (DOX) ou a metotrexato (MTX) foram identificadas alterações metabólicas mais ténues, com a quase total ausência de alterações no teor de lípidos. Foram também detetadas alterações em metabolitos relacionados com o ciclo de Krebs, stress oxidativo e metabolismo de nucleótidos, interpretadas tentativamente à luz dos mecanismos de ação de cada um dos fármacos. O impacto metabólico da exposição de células MG-63 e osteoblastos a cDDP e ao complexo de Pd2Spm é apresentado no Capítulo 6. Os resultados mostram que, apesar de ambos os fármacos poderem ligar ao DNA, as alterações metabólicas que decorrem da sua ação são muito distintas, nomeadamente no que respeita às variações nos teores de lípidos (ausentes para Pd2Spm). Ensaios de medição de apoptose mostraram que, contrariamente ao verificado para células MG-63 expostas a cDDP, a redução do número de células por exposição a Pd2Spm não se deve a fenómenos de morte celular por apoptose ou necrose. Além disso, este último complexo exerce um efeito mais marcado em osteoblastos do que nas células cancerígenas, o inverso parecendo acontecer com a exposição a cDDP. Contudo, os resultados da exposição de células MG-63 a regimes de tratamento combinado com base em cocktails de cDDP ou Pd2Spm, descritos no Capítulo 7, mostram que, em combinação, os dois agentes induzem respostas metabólicas semelhantes entre si, decorrentes de mecanismos de sinergia entre fármacos. Finalmente, sumariam-se no Capítulo 8 as conclusões deste trabalho e apontam-se perspetivas de trabalho futuro.