The p22HBP heme binding protein: an NMR study of the dynamics and heme-protein interactions

Abstract

The work presented in this Thesis investigates the dynamics and molecular interactions of p22HBP and the p22HBP-tetrapyrrole complex. Specifically, the key residues involved when a tetrapyrrole binds to p22HBP were sought. Previous molecular modelling studies identified three possible charged residues R56, K64 and K177 as possibly being important in tetrapyrrole binding via electrostatic interactions with the propionate groups of the tetrapyrrole. A number of variants of murine p22HBP were therefore prepared and fluorescence quenching and NMR used to verify the integrity of the variants and their interaction with tetrapyrrole. The same molecular modelling studies identified a mobile loop Y171-R180 in p22HBP that decreased in mobility on tetrapyrrole binding, therefore to confirm this mobility change dynamics studies based on NMR relaxation experiments were carried out. Finally in order to obtain a non heme-binding form of human p22HBP a chimeric p22HBP was designed and constructed. This construct, and the resulting protein, will be important for future siRNA knockdown studies where rescue or recovery of function experiments are required to prove the knockdown results. Chapter one discusses the current state of the art in terms of the biological, structural and functional aspects of p22HBP. The main objectives of the Thesis are also introduced here. Chapter two presents a detailed description of the different expression vectors (pNJ2 and pet28-a) and procedures used for overexpression and purification of murine p22HBP and its variants and human p22HBP. All expression and purification systems used gave good yields and allowed isotopic labeling to be carried out. The fluorescence quenching results for tetrapyrrole binding to murine p22HBP and variants are presented in chapter three along with the dissociation constants that were found to be in the nanomolar range for wild type murine and human p22HBP. The same studies were performed for murine p22HBP variants, with hydrophobic and polar changes being introduced at R56, K64 and K177. The dissociation constants were found to double in some cases but no significant changes in the strength of hemin-protein interactions were observed. The tetrapyrrole interaction with p22HBP was also followed by NMR spectroscopy, where chemical shift mapping was used to identify binding pocket location. All the variants and wild type human p22HBP were found to bind at the same location. Chapter 4 contains the data from 2D and 3D experiments carried out on 15N/13C labelled human p22HBP that was used to obtain backbone assignments. Comparison with wild type murine p22HBP assignments, PPIX titrations and theoretical calculations based on chemical shifts (Talos+) allowed 82% of the backbone resonances to be assigned. The results from the relaxation experiments used to probe the dynamics of the mobile loop in p22HBP on binding to tetrapyrrole are presented in chapter 5. The overall protein was found to tumble isotropically in the free and bound forms however the results to probe mobility changes in the 171-180 loop on tetrapyrrole binding proved inconclusive as only residue could be assigned and this did not seem to become significantly less mobile. The final chapter describes the design and construction of a chimeric p22HBP. For these purpose, the alfa1-helix sequence of human p22HBP in the phHBP1 plasmid was replaced by its homologous sequence in hSOUL, a non heme-binding protein with identical 3D structure. The results however indicated that either the incorrect sequence was introduced into the plasmid or the purification procedure was inadequate.

O trabalho apresentado nesta Tese focou-se na dinâmica e nas interações moleculares da p22HBP e do complexo p22HBP-tetrapirrol, nomeadamente nos resíduos chave envolvidos nesta interação. Estudos prévios de modelação molecular identificaram três possíveis resíduos chave R56, K64 e K177 como sendo importantes na interação com os tetrapirróis, através de interações eletrostáticas com os grupos propionato do tetrapirrol. Foram desenhados e construídos variantes da p22HBP murina e foram desenvolvidos estudos de extinção de fluorescência e RMN para avaliar a integridade dos variantes e a sua interação com os tetrapirróis. Os mesmos estudos de modelação molecular identificaram ainda uma zona flexível (Y171-R180) na p22HBP que diminui a mobilidade com a interação do tetrapirrol. Para confirmar esta alteração de mobilidade, foram realizados estudos de dinâmica, baseados em RMN. Por fim, com o intuito de obter uma versão não funcional da p22HBP humana, foi planeada e construída uma versão quimérica da p22HBP humana. No futuro, esta nova versão da p22HBP quimérica, será importante para os estudos de knockdown envolvendo siRNA. O capítulo um introduz uma revisão dos aspetos biológicos da p22HBP nomeadamente os estudos estruturais e as possíveis funções que foram identificadas. Os principais objetivos da tese são também apresentados neste capítulo. No capítulo dois é apresentada uma descrição detalhada dos diferentes vectores de sobreexpressão (pNJ2 e pet28-a) e dos métodos de sobreexpressão e purificação da p22HBP murina e respectivos variantes, bem como da p22HBP humana. Todos os sistemas de sobreexpressão e purificação utilizados obtiveram bons rendimentos e permitiram a marcação isotópica das proteínas. No capítulo 3 são apresentados os resultados de extinção de fluorescência para a interação da p22HBP murina e humana com hemina através das constantes de dissociação determinadas na ordem dos nanomolar. Os mesmos estudos foram realizados para os variantes da p22HBP murina, com alterações hidrofóbicas e de polaridade nos resíduos R56, K64 e K177. Em alguns casos, as constantes de dissociação determinadas são mais elevadas, embora não se tenham verificado alterações significativas na força da interação proteína-hemo. As interações tetrapirrólicas com a p22HBP foram também estudadas por espectroscopia de RMN, onde foram mapeadas as diferenças nos desvios químicos para identificar a localização da zona de interação. A localização da zona de interação dos variantes da p22HBP e a p2HBP humana mantém-se igual à p22HBP murina. No capítulo 4 encontram-se os resultados das experiências 2D e 3D realizadas na p22HBP humana, isotopicamente marcada com 15N/13C, para identificar as ressonâncias da cadeia principal. 82% dos sistemas de spin da cadeia principal foram identificados através da comparação com a p22HBP murina, das titulações com PPIX e de cálculos teóricos baseados nos desvios químicos (Talos+). No capítulo 5 são apresentados os resultados das experiências de relaxação, usados para comprovarem a dinâmica do loop na p22HBP aquando da interação com o tetrapirrol. A proteína no seu todo move-se de uma forma isotrópica na forma livre e ligada. No entanto os resultados para comprovar as alterações de mobilidade no loop 171-180 na presença de hemo, foram inconclusivos uma vez que só a um resíduo foi atribuído um sistema de spin, e não foi indicativo da perda significativa de mobilidade. O último capítulo descreve o planeamento e a construção da p22HBP quimérica. Para tal, a sequência que codifica a hélix alfa 1 da p22HBP humana, no plasmídeo phHBP1, foi substituída pela sequência homóloga da SOUL humana, uma proteína com uma estrutura 3D semelhante mas não liga ao hemo. Os resultados no entanto demonstraram que ou a sequência não foi introduzida corretamente no plasmídeo ou o sistema de purificação não foi adequado.