Structural characterization and biological activity of polysaccharides from infusions used in the popular tradition

Abstract

The use of plants with medicinal purposes is an ancient practice still very common in developing regions, and is rapidly spreading in industrialized countries. This fact is evidenced by the large number of ethnobotanical studies found in the literature referring that these plants are often used as decoctions and infusions. In most studies the reported biological activities are attributed to the presence of phenolic compounds, due to their antioxidant properties, and to polysaccharides, with its anti-tumoral properties. In “Trás-os-Montes” region, some of the most popular infusions used by the popular medicine are prepared with the dried leaves of Fraxinus angustifolia, the dried shoots of Mentha suaveolens, and the dried inflorescences of Pterospartum tridentatum. However, there are no studies about the polysaccharides present in these infusions. Thus, through the structural characterization of the polysaccharides present in the infusions of F. angustifolia, M. suaveolens, and P. tridentatum, the present PhD thesis intends to evaluate the possible relation between polysaccharides and the immunostimulatory activity that these infusions might present. In a preliminary phase, infusions of F. angustifolia were prepared according to the popular tradition, and it was observed that the obtained water soluble material contained approximately 85% of material non-retained in C18 cartridges, with hydrophilic characteristics, with the remaining 15% comprising retained-material with hydrophobic characteristics. It was also shown that the infusions only contained between 2 and 4% of high molecular weight material (HMWM), which comprised approximately 30% of carbohydrate material. Sugar and methylation analysis of the HMWM suggested the presence of pectic polysaccharides, together with type II arabinogalactans, mannans, and xyloglucans. However, the amount of material obtained is to low for the fractionation, and structural analysis of the polysaccharides present. The 4 h decoction, divided in two periods of 2 h, with water renewal, allowed to increase the HMWM yield, relatively to the infusions traditional infusions. It was also observed that the decoction also allowed to increase the HMWM proportion of carbohydrate material, due to an increase in the proportion of uronic acid present, although the neutral sugar residues seemed to be detected in similar proportions. Therefore, in all the experiments subsequently performed, the HMWM used was obtained through the decoction of F. angustifolia dried leaves, M. suaveolens dried shoots, and P. tridentatum dried inflorescences. x After the fractionation, through ethanol precipitation, and anion exchange chromatography, of the polysaccharides from the HMWM obtained by the decoction of the vegetable material of the distinct studied plants, it was observed the presence of high proportions of pectic polysaccharides, containing type I arabinogalactans, together with minor proportions of type II arabinogalactans, mannans, and xyloglucans. The presence of pectic polysaccharides in the extracts from F. angustifolia was also evidenced through endo-polygalacturonase treatment, and ESI-MS and ESI-MS/MS experiments. The detection of linked pentose and uronic acid residues, also seemed to suggest the presence of xylogalacturonan domains in the pectic polysaccharides from F. angustifolia. The extracts from F. angustifolia dried leaves also contained type II arabinogalactans that exhibited a higher structural diversity than those detected in the M. suaveolens, and P. tridentatum extracts, particularly in the substitution degree of the galactan backbone, and in the extension of the (1→5)-Araf side chains. Moreover, for all the plants studied, it was also observed that the type II arabinogalactans, extracted during the 2nd 2h of the extraction process, exhibited a substitution degree of the galactan backbone higher than those extracted during the 1st 2h. The extracts from P. tridentatum dried inflorescences contained higher proportions of mannans, and also of xyloglucans, both presenting a substitution degree higher than those, which were detected in lower proportion in the extracts of F. angustifolia and M. suaveolens. Through ESI-MS and ESI-MS/MS it was possible to evidence that the mannans present in the extracts of P. tridentatum presented acetyl groups on the O-2 of the mannosyl residues. It was also evidenced that the P. tridentatum mannans were more extensively acetylated than the mannans detected in the coffee infusion, LBG, and other non-conventional mannan sources. Moreover, it was detected the presence of oligosaccharides comprising hexose residues linked to non acetylated pentose residues, suggesting the possible presence of arabinose residues in the mannans from P. tridentatum extracts. The immunostimulatory activity of three fractions isolated from the extracts of F. angustifolia, M. suaveolens, and P. tridentatum, was tested and an increase in the NO production by macrophages, without compromising their cellular viability, was observed. The type I, and type II arabinogalactans detected in the extracts from F. angustifolia, and M. suaveolens seem to have contributed for the observed immunostimulatory activity. For the fraction from P. tridentatum, the mannans acetylation, and the presence of type I, and type II arabinogalactans seemed to contribute for the macrophage immunostimulatory activity observed. The possible presence of storage xyloglucans from the inflorescences seeds, also seems to have contributed for the immunostimulatory activity registered when the macrophages were stimulated with higher extract concentrations. The results obtained allow to conclude that the extracts of F. angustifolia dried leaves, M. suaveolens dried shoots, and P. tridentatum dried inflorescences contained high proportions of pectic polysaccharides, exhibiting type I arabinogalactans, together with other polysaccharides, such as type II arabinogalactans, mannans, and xyloglucans. This polysaccharide mixture seems to have contributed to the immunostimulatory activity of fractions isolated from the extracts of the studied plants. Therefore, as the same type of polysaccharides seem to be present in the decoctions and in the infusions, it seems possible that the polysaccharides might contribute for the therapeutic properties frequently associated by the popular tradition to the infusions of these plants.

O uso de plantas com fins medicinais é uma prática antiga, ainda bastante frequente em regiões de países em desenvolvimento, e que se tem vindo a disseminar em países mais industrializados. Este facto é suportado pelo elevado número de estudos etnobotânicos, onde se refere que estas plantas são frequentemente usadas na forma de decocções e infusões. Na maioria dos estudos as atividades biológicas são associadas à presença de compostos fenólicos e às suas propriedades antioxidantes, assim como aos polissacarídeos, nomeadamente devido às propriedades antitumorais. Na região de Trás-os-Montes, algumas das infusões mais utilizadas pela medicina popular têm por base as folhas secas do freixo (Fraxinus angustifolia), a parte aérea seca do mondrasto (Mentha suaveolens) e as inflorescências secas da carqueja (Pterospartum tridentatum). No entanto, não existe nenhum estudo sobre os polissacarídeos presentes nas infusões das folhas secas do freixo (Fraxinus angustifolia), da parte aérea do mondrasto (Mentha suaveolens) ou das inflorescências da carqueja (Pterospartum tridentatum). Deste modo, com a presente dissertação pretende-se, através da caracterização estrutural dos polissacarídeos presentes nas infusões de F. angustifolia, M. suaveolens e P. tridentatum, avaliar a possível relação entre os polissacarídeos e a atividade imunoestimuladora que estas infusões possam apresentar. Numa primeira fase, foram preparadas infusões tradicionais de F. angustifolia, tendo-se mostrado que o material solúvel das infusões continha cerca de 85% de material não retido em cartuchos C18 com características hidrofílicas, sendo os restantes 15% compostos por material retido de características hidrofóbicas. Mostrou-se ainda que as infusões obtidas apenas continham cerca de 2 a 4% de material de alto peso molecular (HMWM), que era composto por cerca de 30% de carboidratos. A análise de açúcares e a análise de metilação do HMWM sugeriu a presença de polissacarídeos pécticos, em conjunto com arabinogalactanas do tipo II, mananas e xiloglucanas. No entanto, a quantidade de material obtido é muito baixa para o fracionamento e a análise estrutural dos polissacarídeos presentes. A decocção de 4 h, divididas em 2 períodos de 2 h, com renovação da água, permitiu um aumento no rendimento em HMWM, relativamente às infusões tradicionais. Verificou-se ainda, que a decocção também permitiu aumentar a proporção de carboidratos no HMWM, particularmente devido ao aumento da proporção de ácido urónico presente, embora os resíduos de açúcares neutros se encontrassem em proporção semelhante. Deste modo, em todas as experiências realizadas posteriormente, o HMWM utilizado foi obtido através da decocção das folhas secas de F. angustifolia, da parte aérea seca de M. suaveolens e das inflorescências secas de P. tridentatum. Após fracionamento por precipitação em etanol e cromatografia de troca aniónica dos polissacarídeos presentes no HMWM obtido através da decocção dos materiais vegetais das diferentes plantas estudadas, verificou-se a presença de elevadas proporções de polissacarídeos pécticos, contendo arabinogalactanas do tipo I, em conjunto com menores proporções de arabinogalactanas do tipo II, mananas e xiloglucanas. A presença de polissacarídeos pécticos nos extratos de F. angustifolia foi também evidenciada através do tratamento enzimático com endopoligalacturonase e de experiências de ESI-MS e ESI-MS/MS. A deteção de resíduos de pentose ligados a resíduos de ácido urónico também pareceu indicar a presença de domínios de xilogalacturonana nos polissacarídeos pécticos de F. angustifolia. Os extratos das folhas secas de F. angustifolia mostraram conter arabinogalactanas do tipo II com uma maior diversidade estrutural do que as que foram detetadas nos extratos de M. suaveolens e P. tridentatum, particularmente no que diz respeito à substituição das cadeias de (1→3)-Galp e à extensão das cadeias laterais compostas por resíduos de (1→5)-Araf. Para além disso, verificou-se que, para todas as plantas estudadas, as arabinogalactanas do tipo II presentes nas frações obtidas durante a segunda parte do processo de extração apresentaram uma substituição das cadeias de (1→3)-Galp maior do que as extraídas durante a primeira parte da extração. Os extratos das inflorescências de P. tridentatum continham maiores proporções de mananas e de xiloglucanas, tendo-se detetado estruturas que apresentaram um maior grau de substituição do que as que foram detetadas em menores proporções nos extratos de F. angustifolia e M. suaveolens. Através das técnicas de ESI-MS e ESI-MS/MS, foi possível demonstrar que as mananas presentes nos extratos de P. tridentatum se encontravam acetiladas no O-2 dos resíduos de manose. Verificou-se que as mananas presentes nos extratos de P. tridentatum se encontravam acetiladas em maior extensão do que as mananas detetadas na infusão do café, na goma de alfarroba e em outras fontes não convencionais de mananas. Para além disso, também foram detetados oligossacarídeos contendo resíduos de pentose, ligados a resíduos de hexose, sugerindo a presença de resíduos de arabinose na estrutura das mananas de P. tridentatum. A atividade imunoestimuladora de três frações isoladas a partir dos extratos de F. angustifolia, M. suaveolens e P. tridentatum foi avaliada, tendo-se observado o aumento da produção de NO por parte de macrófagos, sem comprometer a sua viabilidade celular. As arabinogalactanas do tipo I e II parecem contribuir para a atividade imunoestimuladora observada nas frações dos extratos de F. angustifolia e de M. suaveolens No caso da fração obtida a partir dos extratos de P. tridentatum, a acetilação das mananas, bem como a presença de arabinogalactanas do tipo I e II parecem ter contribuído para a atividade imunoestimuladora dos macrófagos observada. A possível presença de xiloglucanas de armazenamento, provenientes das sementes das inflorescências de P. tridentatum, também poderá contribuir para a atividade imunoestimuladora observada quando os macrófagos foram estimulados com maiores concentrações de extrato. Os resultados obtidos permitem concluir que os extratos das folhas secas de F. angustifolia, da parte aérea de M. suaveolens e das inflorescências de P. tridentatum contêm elevadas proporções de polissacarídeos pécticos, contendo arabinogalactanas do tipo I, misturados com outros polissacarídeos, tais como arabinogalactanas do tipo II, mananas e xiloglucanas. Esta mistura de polissacarídeos mostrou contribuir para a atividade imunoestimuladora de frações isoladas a partir dos extratos das plantas estudadas. Deste modo, e como o mesmo tipo de polissacarídeos parece estar presente nas infusões e decoções, é possível que os polissacarídeos possam contribuir para as propriedades terapêuticas frequentemente atribuídas pela tradição popular às infusões destas plantas.