Investigation of a cfr-like gene from Clostridium

Abstract

The aim of this project was, primarily, to clone, express and investigate the function of a cfr-like gene from Clostridium sporogenes (clcs) in E. coli and, subsequently, to investigate the function of the clcs gene in C. sporogenes, its natural host, and ascertain possible variations in function. The cfr and cfr-like genes were cloned into a plasmid, which allowed their constitutive expression in E. coli. The ClCs protein was not able to mediate changes in the antibiotic susceptibility of E. coli compared to the PhLOPSA phenotype conferred by the Cfr methyltransferase. The lack of function of the expressed protein was also investigated by combining parts of the cfr and clcs genes, but no MIC changes were observed. Attending to the Cfr methyltransferase function, the verification of the presence or absence of the RNA methylation at A2503 in 23S rRNA from E. coli was checked by primer extension, showing that the ClCs-containing strain E. coli JW2501-1 does not give rise to any stop at A2503, revealing that the Cfr-like protein from C. sporogenes does not methylate E. coli 23S RNA, which is consistent with the MIC results. Since it was not possible to conclude that ClCs does not have a Cfr-like function, further investigation was required to determine if ClCs could be able to methylate C. sporogenes 23S RNA and act as Cfr. Two C. sporogenes strains reported as cfr-like gene carriers were investigated. The attempts to amplify the cfr-like genes revealed that the assumption that both these C. sporogenes strains contained a cfr-like gene seemed to be true for only one of them. MICs showed that the cfr-like gene-containing C. sporogenes strain has lower susceptibility to all the PhLOPSA antibiotics tested than the presumably Cfr-lacking C. sporogenes strain. The uncertain function of the ClCs protein was then investigated by primer extension to look for an indication of modification at A2503 23S RNA from C. sporogenes (E. coli numbering). As a similar stop was observed for both strains, mass spectrometry was performed revealing a mono-methylation at A2503, probably caused by the housekeeping RlmN protein and not by Cfr. Another possible modification in the area around A2503 was detected and should be further analyzed.

O objectivo deste projeto foi, inicialmente, clonar, expressar e investigar a função de um gene cfr-like de Clostridium sporogenes (clcs) em E. coli e, posteriormente, investigar a função do gene clcs em C. sporogenes, o seu hospedeiro original, verificando possíveis variações na sua função. Os genes cfr e cfr-like foram clonados num plasmídeo, o que permitiu a expressão constitutiva dos genes em E. coli. A proteína ClCs não mediou alterações na susceptibilidade de E. coli aos antibióticos, em comparação com o fenótipo PhLOPSA conferido pela metiltransferase Cfr. A ausência de função das proteínas expressas foi também investigada através da combinação de partes dos genes cfr e clcs, contudo não foram observadas alterações nas MICs. Tendo em conta a função da metiltransferase Cfr, a verificação da presença ou ausência da metilação na posição A2503 do rRNA 23S de E. coli foi analisada por primer extension, mostrando que a estirpe E. coli JW2501-1 que compreende a proteína ClCs não dá origem a qualquer stop na posição A2503, demonstrando que a proteína Cfr-like de C. sporogenes não metila o RNA 23S de E. coli, o que é consistente com os resultados das MICs. Uma vez que não foi possível concluir que a proteína ClCs não possui a função de uma proteína Cfr-like, foi necessária uma investigação mais aprofundada para determinar se a proteína ClCs poderia metilar o RNA 23S de C. sporogenes e funcionar como Cfr. Duas estirpes de C. sporogenes apontadas como portadoras do gene cfr-like foram investigadas. As tentativas para amplificar os genes cfr-like revelaram que a hipótese de ambas as estirpes conterem um gene cfr-like parecia ser verdade para apenas uma delas. As MICs mostraram que a estripe C. sporogenes que compreende o gene cfr-like tem menor susceptibilidade a todos os antibióticos PhLOPSA testados do que a presumível estirpe de C. sporogenes que não possui a proteína Cfr. A função dúbia da proteína ClCs foi então investigada por primer extension na tentativa de encontrar alguma modificação na posição A2503 do RNA 23S de C. sporogenes (numeração em E. coli). Como foi observado um stop semelhante em ambas as estirpes, foi realizada espectrometria de massa, revelando uma mono-metilação na posição A2503, provavelmente causada pela proteína housekeeping RlmN e não pela Cfr. Uma outra possível modificação em torno da posição A2503 foi detectada e deverá ser posteriormente analisada.