Microbe-mediated recovery of salt marshes contaminated with oil hydrocarbons

Abstract

Salt marshes are highly productive intertidal habitats that serve as nursery grounds for many commercially and economically important species. Because of their location and physical and biological characteristics, salt marshes are considered to be particularly vulnerable to anthropogenic inputs of oil hydrocarbons. Sediment contamination with oil is especially dangerous for salt marsh vegetation, since low molecular weight aromatic hydrocarbons can affect plants at all stages of development. However, the use of vegetation for bioremediation (phytoremediation), by removal or sequestration of contaminants, has been intensively studied. Phytoremediation is an efficient, inexpensive and environmental friendly approach for the removal of aromatic hydrocarbons, through direct incorporation by the plant and by the intervention of degrading microbial populations in the rhizosphere (microbe-assisted phytoremediation). Rhizosphere microbial communities are enriched in important catabolic genotypes for degradation of oil hydrocarbons (OH) which may have a potential for detoxification of the sediment surrounding the roots. In addition, since rhizosphere bacterial populations may also internalize into plant tissues (endophytes), rhizocompetent AH degrading populations may be important for in planta AH degradation and detoxification. The present study involved field work and microcosms experiments aiming the characterization of relevant plant-microbe interactions in oilimpacted salt marshes and the understanding of the effect of rhizosphere and endosphere bacteria in the role of salt marsh plants as potential phytoremediation agents. In the field approach, molecular tools were used to assess how plant species- and OH pollution affect sediment bacterial composition [bulk sediment and sediment surrounding the roots (rhizosphere) of Halimione portulacoides and Sarcocornia perennis subsp. perennis] in a temperate estuary (Ria de Aveiro, Portugal) chronically exposed to OH pollution. In addition, the 16S rRNA gene sequences retrieved in this study were used to generate in silico metagenomes and to evaluate the distribution of potential bacterial traits in different microhabitats. Moreover, a combination of culture-dependent and -independent approaches was used to investigate the effect of oil hydrocarbons contamination on the structure and function of endophytic bacterial communities of salt marsh plants.Root systems of H. portulacoides and S. perennis subsp. perennis appear to be able to exert a strong influence on bacterial composition and in silico metagenome analysis showed enrichment of genes involved in the process of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) degradation in the rhizosphere of halophyte plants. The culturable fraction of endophytic degraders was essentially closely related to known OH-degrading Pseudomonas species and endophytic communities revealed sitespecific effects related to the level of OH contamination in the sediment. In order to determine the effects of oil contamination on plant condition and on the responses in terms of structure and function of the bacterial community associated with plant roots (rhizosphere, endosphere), a microcosms approach was set up. The salt marsh plant Halimione portulacoides was inoculated with a previous isolated Pseudomonas sp. endophytic degrader and the 2-methylnaphthalene was used as model PAH contaminant. The results showed that H. portulacoides health and growth were not affected by the contamination with the tested concentration. Moreover, the decrease of 2-methylnaphthalene at the end of experiment, can suggest that H. portulacoides can be considered as a potential plant for future uses in phytoremedition approaches of contaminated salt marsh. The acceleration of hydrocarbon degradation by inoculation of the plants with the hydrocarbon-degrading Pseudomonas sp. could not, however, be demonstrated, although the effects of inoculation on the structure of the endophytic community observed at the end of the experiment indicate that the strain may be an efficient colonizer of H. portulacoides roots. The results obtained in this work suggest that H. portulacoides tolerates moderate concentrations of 2-methylnaphthalene and can be regarded as a promising agent for phytoremedition approaches in salt marshes contaminated with oil hydrocarbons. Plant/microbe interactions may have an important role in the degradation process, as plants support a diverse endophytic bacterial community, enriched in genetic factors (genes and plasmids) for hydrocarbon degradation.

As zonas de sapal são ambientes intertidais altamente produtivos, que servem como áreas de reprodução para muitas espécies com grande importância a nível comercial e económico. Devido à sua localização e às suas características físicas e biológicas, os sapais são particularmente susceptíveis à exposição a hidrocarbonetos com origem antropogénica. A contaminação dos sedimentos com hidrocarbonetos de petróleo é especialmente nociva para a vegetação de sapal, uma vez que os hidrocarbonetos aromáticos de baixo peso molecular podem afectar todos os estágios de desenvolvimento das plantas. No entanto, a utilização de plantas para biorremediação (fitorremediação) por remoção ou captura de compostos tóxicos, tem sido amplamente estudada. A fitorremediação é encarada como uma abordagem eficiente, económica e de baixo impacto ambiental para remoção de hidrocarbonetos aromáticos, que envolve a intervenção directa das plantas coadjuvada pela atividade das populações microbianas degradadoras na rizosfera (fitorremediação assistida por microrganismos). Nas rizosferas desenvolvem-se comunidades de microorganismos equipados com genes catabólicos relacionados com a degradação de hidrocarbonetos do petróleo (OH), com potencial na destoxificação do sedimento em torno destas raízes. Além disso, uma vez que algumas bactérias da rizosfera são também capazes de colonizar os tecidos das plantas (bactérias endofíticas), designadamente da raiz, as comunidades rizocompetentes degradadoras de OH são importantes para a degradação de OH ״in planta“ e contribuem para o seu papel como agentes de biorremediação. Este trabalho envolveu uma componente de campo e uma compoente laboratorial desenvolvida em microcosmos, com o objectivo de caracterizar interacções planta-bactéria relevantes na bioremediação de sapais contaminados com hidrocarbonetos e optimizar combinações planta-bactéria para uma melhoria da sobrevivência das plantas e aceleração da degradação dos poluentes. Na abordagem de campo, foram utilizadas ferramentas moleculares para avaliar como o tipo de espécie de planta e a contaminação com hidrocarbonetos afetam a composição das comunidades bacterianas do sedimento [sedimentos sem vegetação e sedimentos em torno das raízes (rizosfera) das espécies Halimione portulacoides e Sarcocornia perennis subsp. perennis] num estuário temperado (Ria de Aveiro, Portugal) cronicamente exposto à poluição por OH.As sequências de genes de rRNA 16S obtidas neste estudo foram usadas para gerar metagenomas “in silico” e inferir tendências nos perfis funcionais das comunidades bacterianas em diferentes microhabitats. Posteriormente, uma combinação de métodos dependentes e independentes de cultivo foi utilizada para investigar o efeito de contaminação com OH sobre a estrutura e função da comunidade bacteriana endófitica das halófitas. Os sistemas radiculares de H. portulacoides e S. perennis subsp. perennis parecem exercer uma forte influência sobre a composição bacteriana e a análise metageomica “in silico” revelou um enriquecimento em genes envolvidos no processo de degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs) na rizosfera de plantas halófitas. Na fracção cultivável de endofíticas degradadoras foram detetadas com particular frequência, espécies de Pseudomonas conhecidas como degradadoras de OH. As comunidades endofíticas revelaram um efeito local, relacionado com características do sedimento, tal como, o nível de contaminação de OH. A fim de determinar se a inoculação da H. portulacoides com bactérias degradadoras de hidrocarbonetos podem mitigar os efeitos negativos da exposição das plantas à contaminação por hidrocarbonetos, bem como avaliar as respostas em termos de estrutura e função das comunidades bacterianas associada à raíz de plantas (rizosfera e endosfera), foi desenvolvida uma experiência de microcosmos. A halófita Halimione portulacoides foi inoculada com uma estirpe de Pseudomonas sp., uma bactéria endofítica degradadora previamente isolada, e cultivada em sedimentos experimentalmente adicionados com 2-metilnaftaleno. Embora os resultados não tenham demonstrado um efeito significativo do contaminante sobre a condição da planta, a redução da concentração de 2-metilnaftaleno no sedimento no final da experiência sugere que H. portulacoides pode ser considerada como uma planta com potencial interesse para aplicação na fitorremediação de zonas de sapal contaminadas com hidrocarbonetos aromáticos. Apesar da degradação do hidrocarboneto não ter sido acelerada pela inoculação das plantas com uma estirpe de Pseudomonas sp. degradadora, esta parece ter exercido um efeito positivo sobre a condição das plantas, independentemente da adição de 2-metilnaftaleno. Os efeitos da inoculação sobre a estrutura da comunidade endófitica observada no final da experiência indicam que a estirpe pode ser uma colonizadora eficiente das raízes da H. portulacoides. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a H. portulacoides tolera concentrações moderadas de 2-metilnaftaleno podendo assim ser considerada como um agente promissor para processos de fitoremediação em sapais contaminados com hidrocarbonetos de petróleo. As plantas suportam comunidades bacterianas endofíticas diversas e enriquecidas em fatores géneticos (genes) relacionados com degradação de hidrocarbonetos e as interações planta/bactéria podem assumir um importante papel nos processos de degradação.