Metabolic signature of lung cancer: a metabolomic study of human tissues and biofluids

Abstract

This thesis reports the application of metabolomics to human tissues and biofluids (blood plasma and urine) to unveil the metabolic signature of primary lung cancer. In Chapter 1, a brief introduction on lung cancer epidemiology and pathogenesis, together with a review of the main metabolic dysregulations known to be associated with cancer, is presented. The metabolomics approach is also described, addressing the analytical and statistical methods employed, as well as the current state of the art on its application to clinical lung cancer studies. Chapter 2 provides the experimental details of this work, in regard to the subjects enrolled, sample collection and analysis, and data processing. In Chapter 3, the metabolic characterization of intact lung tissues (from 56 patients) by proton High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is described. After careful assessment of acquisition conditions and thorough spectral assignment (over 50 metabolites identified), the metabolic profiles of tumour and adjacent control tissues were compared through multivariate analysis. The two tissue classes could be discriminated with 97% accuracy, with 13 metabolites significantly accounting for this discrimination: glucose and acetate (depleted in tumours), together with lactate, alanine, glutamate, GSH, taurine, creatine, phosphocholine, glycerophosphocholine, phosphoethanolamine, uracil nucleotides and peptides (increased in tumours). Some of these variations corroborated typical features of cancer metabolism (e.g., upregulated glycolysis and glutaminolysis), while others suggested less known pathways (e.g., antioxidant protection, protein degradation) to play important roles. Another major and novel finding described in this chapter was the dependence of this metabolic signature on tumour histological subtype. While main alterations in adenocarcinomas (AdC) related to phospholipid and protein metabolisms, squamous cell carcinomas (SqCC) were found to have stronger glycolytic and glutaminolytic profiles, making it possible to build a valid classification model to discriminate these two subtypes. Chapter 4 reports the NMR metabolomic study of blood plasma from over 100 patients and near 100 healthy controls, the multivariate model built having afforded a classification rate of 87%. The two groups were found to differ significantly in the levels of lactate, pyruvate, acetoacetate, LDL+VLDL lipoproteins and glycoproteins (increased in patients), together with glutamine, histidine, valine, methanol, HDL lipoproteins and two unassigned compounds (decreased in patients). Interestingly, these variations were detected from initial disease stages and the magnitude of some of them depended on the histological type, although not allowing AdC vs. SqCC discrimination. Moreover, it is shown in this chapter that age mismatch between control and cancer groups could not be ruled out as a possible confounding factor, and exploratory external validation afforded a classification rate of 85%. The NMR profiling of urine from lung cancer patients and healthy controls is presented in Chapter 5. Compared to plasma, the classification model built with urinary profiles resulted in a superior classification rate (97%). After careful assessment of possible bias from gender, age and smoking habits, a set of 19 metabolites was proposed to be cancer-related (out of which 3 were unknowns and 6 were partially identified as N-acetylated metabolites). As for plasma, these variations were detected regardless of disease stage and showed some dependency on histological subtype, the AdC vs. SqCC model built showing modest predictive power. In addition, preliminary external validation of the urine-based classification model afforded 100% sensitivity and 90% specificity, which are exciting results in terms of potential for future clinical application. Chapter 6 describes the analysis of urine from a subset of patients by a different profiling technique, namely, Ultra-Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (UPLC-MS). Although the identification of discriminant metabolites was very limited, multivariate models showed high classification rate and predictive power, thus reinforcing the value of urine in the context of lung cancer diagnosis. Finally, the main conclusions of this thesis are presented in Chapter 7, highlighting the potential of integrated metabolomics of tissues and biofluids to improve current understanding of lung cancer altered metabolism and to reveal new marker profiles with diagnostic value.

A presente tese reporta a aplicação da metabolómica ao estudo de tecidos e biofluidos humanos (plasma sanguíneo e urina), com o intuito de caracterizar a assinatura metabólica do cancro pulmonar primário. No Capítulo 1, apresenta-se uma breve introdução sobre a epidemiologia e a patogénese deste tipo de cancro, bem como um sumário das principais alterações metabólicas tipicamente associadas ao cancro em geral. Descreve-se ainda a abordagem metabolómica, nomeadamente os métodos analíticos e estatísticos utilizados, assim como o estado da arte da sua aplicação em estudos clínicos do cancro do pulmão. No Capítulo 2, apresentam-se os detalhes experimentais deste trabalho, no que diz respeito ao grupo de indivíduos envolvidos, à colheita e análise das amostras e ao posterior tratamento dos dados. O Capítulo 3 descreve a caracterização metabólica de tecidos do pulmão (de 56 doentes) por espetroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de alta resolução com rotação no ângulo mágico. Após a otimização cuidada das condições de aquisição e a identificação detalhada dos sinais espetrais (mais de 50 metabolitos identificados), os perfis metabólicos dos tumores e dos tecidos adjacentes não envolvidos (controlos) foram comparados por análise multivariada, tendo sido discriminados com uma exatidão de 97%. Os metabolitos que mais significativamente contribuíram para esta diferenciação foram: glucose e acetato (diminuídos nos tumores), lactato, alanina, glutamato, GSH, taurina, creatina, fosfocolina, glicerofosfocolina, fosfoetanolamina, nucleótidos de uracilo e péptidos (aumentados nos tumores). Algumas destas variações corroboraram alterações típicas do metabolismo do cancro (e.g., glicólise e glutaminólise aumentadas), enquanto outras sugeriram novas pistas sobre a possível relevância de processos como a proteção antioxidante e a degradação proteica. Um outro resultado novo e importante descrito neste capítulo foi a dependência da assinatura metabólica em relação ao tipo histológico do tumor. Enquanto as principais alterações observadas nos adenocarcinomas (AdC) se relacionaram com o metabolismo fosfolipídico e proteico, os carcinomas de células escamosas (SqCC) apresentaram perfis glicolíticos e glutaminolíticos mais pronunciados, sendo possível construir um modelo válido para a discriminação destes subtipos. No Capítulo 4, apresenta-se o estudo metabolómico por RMN de plasma sanguíneo de mais de 100 doentes e quase 100 controlos saudáveis, do qual resultou um modelo multivariado com uma taxa de classificação de 87%. A distinção entre os grupos foi feita essencialmente com base nos níveis de lactato, piruvato, acetoacetato, lipoproteínas LDL+VLDL e glicoproteínas (aumentados nos doentes), juntamente com os níveis de glutamina, histidina, valina, metanol, lipoproteínas HDL e dois compostos não identificados (diminuídos nos doentes). Estas variações foram detetadas desde os estádios iniciais da doença e a magnitude de algumas delas dependeu do tipo histológico, embora não permitindo discriminar AdC de SqCC. Para além disso, mostra-se neste capítulo que o desequilíbrio dos grupos controlo e cancro em termos da idade dos indivíduos poderá ter alguma influência nos resultados, e apresenta-se uma tentativa exploratória de validação externa, que resultou numa taxa de classificação de 85%. O estudo por RMN do perfil metabólico da urina dos doentes com cancro do pulmão e dos controlos é apresentado no Capítulo 5. Comparativamente ao plasma, o modelo construído com os perfis urinários apresentou uma taxa de classificação superior (97%). Após uma avaliação cuidada da possível influência do género, idade e hábitos tabágicos, um conjunto de 19 metabolitos foi proposto como estando relacionado com a doença (incluindo 3 compostos desconhecidos e 6 parcialmente identificados como metabolitos N-acetilados). Tal como no caso do plasma, estas variações foram detetadas em doentes no estádio inicial e mostraram alguma dependência em relação ao tipo histológico, obtendo-se um modelo válido para a discriminação AdC vs. SqCC, ainda que com um poder preditivo modesto. Para além disso, o teste preliminar de validação externa revelou 100% de sensibilidade e 90% de especificidade, o que é um resultado bastante promissor em termos da potencial utilização dos perfis urinários em aplicações clínicas futuras. No Capitulo 6, descreve-se a caracterização dos perfis metabólicos da urina (de um subgrupo de indivíduos) por cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada a espetrometria de massa (UPLC-MS). Embora não avançando muito na identificação estrutural de possíveis marcadores, este estudo reforçou o valor diagnóstico da urina, já que os modelos multivariados resultantes apresentaram taxa de classificação e poder preditivo elevados. Finalmente, no Capítulo 7, apresentam-se as principais conclusões deste trabalho, realçando o contributo da metabolómica integrada de tecidos e biofluidos para a compreensão do metabolismo alterado do cancro do pulmão e para a deteção de novos perfis marcadores com valor diagnóstico.