Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/13763
Title: DNA damage and repair in Anguilla anguilla L. exposed to pesticides
Other Titles: Dano e reparação de ADN em Anguilla anguilla L. exposta a pesticidas
Author: Marques, Ana Margarida Lourenço Silva
Advisor: Pacheco, Mário Guilherme Garcês
Keywords: Biologia molecular
Ácido desoxirribonucleico
Pesticidas
Toxicologia ambiental
Defense Date: 2013
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: The presence of pesticides in water bodies is a worrying environmental issue, occurring mainly due to spray-drift, surface runoff or inadvertent applications. This vast class of agrochemicals is known to induce several pernicious effects in non-target aquatic organisms, namely fish. However, data concerning the genotoxic impact of these compounds are scarce. Hence, the present thesis aimed to fill the knowledge lacuna on pesticides capacity to induce genotoxicity to fish, addressing two commercial formulations: Decis®, a deltamethrin-based insecticide, and Roundup®, a glyphosate-based herbicide, each representing a widely used class of biocides. The present work aimed to assess: (i) the chromosomal damaging potential of Decis®, (ii) the DNA damage induction by Roundup®, (iii) the involvement of oxidative processes on the DNA integrity loss as well as (iv) the involvement of DNA repair system in the progression of the DNA damage induced by Roundup®. European eel (Anguilla anguilla L.) was adopted as test organism, performing short-term exposures of 3 days to environmentally realistic concentrations of Decis® and Roundup® and post-exposure evaluations of 1, 7 and 14 days to assess the damage evolution in pesticide-free water. In order to assess the genotoxic damage induced by Decis®, the erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) assay was performed, evaluating chromosomal damage, a hardly repairable type of lesion. In what concerns to Roundup® experiment, the comet assay was adopted as genotoxic endpoint, measuring DNA damage as strand breaks, able to be repaired. In order to assess the involvement of oxidative damage in Roundup®-induced genotoxicity, the comet assay was performed with an extra step, where nucleoids were digested with the endonucleases formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) and endonuclease III (EndoIII), measuring oxidized purines and pyrimidines, respectively. The base excision repair (BER) assay was adopted to evaluate the oxidative DNA damage repair ability of eels exposed in vivo to Roundup®. In general, Decis® and Roundup® demonstrated their genotoxic induction to A. anguilla, since they induced cytogenetic and DNA damage, respectively. In both cases, the damage showed to be of transient nature, since fish were able to completely reverse the previously induced damage. Decis® demonstrated its genotoxic potential by the increase of erythrocytic nuclear abnormalities frequency as a result of its clastogenicity and/or aneugenicity properties. Cytogenetic damage values of exposed eels returned to control levels after 7 days in insecticide-free water. This recovery appeared to be mainly a result from a preferential removal of cells with abnormal nuclear morphology, since no alterations were noticed at the erythropoiesis dynamics. Roundup® was capable of inducing DNA damage in hepatic cells and, though not directly reflected in an increase of breaks at FPG- and EndoIIIsensitive sites, the involvement of oxidative processes in Roundup® genotoxicity was confirmed. The DNA damage values of exposed eels returned to control levels after 1 day in herbicide-free water, mainly due to the repairable condition of this type of damage and the cessation of the exposure. DNA repair enzymes seem to be susceptible to inhibitory actions associated to higher levels of Roundup® constituents/metabolites and/or ROS likely to occur in liver during the exposure period. However, in the postexposure period, an increased capacity to repair oxidative DNA damage emerged, being a crucial pathway for the complete recovery from the genetic damage induced. Evaluating the performance of the genotoxic endpoints adopted in the present study, ENA and comet assays revealed to be suitable to detect the described types of damage. In addition, it became clear that both should be used as complementary tools, since each one measures specific damage types that might be detected at different moments concerning exposure/postexposure periods. In what concerns the management/monitoring practices of pesticides use, the present thesis demonstrated that aquatic biota is under substantial threat and provided useful data to develop stricter regulatory directives. Further studies on this subject should be encouraged, contributing to the increased knowledge and the assessment of the environmental risk to fish populations. In addition, it should be investigated the real impact of pesticides, considering the fish ability to rapidly reverse the short-term effects. This might help the establishment of stricter regulatory procedures aiming the reduction of pesticides overuse and/or inadvertent applications as well as the choice of less toxic compounds.
A ocorrência de pesticidas no meio aquático tornou-se uma questão ambiental de elevada preocupação, considerando que esta vasta classe de compostos pode induzir um leque variado de efeitos nefastos em organismos aquáticos, nomeadamente em peixes. A sua presença em cursos de água é devida, principalmente, a aplicações negligentes, como pulverizações perto dos mesmos e à escorrência dos solos. No entanto, verifica-se uma grave lacuna no que diz respeito à informação científica referente ao seu impacte genotóxico. Deste modo, a presente tese visou avaliar o risco genotóxico em peixes de duas formulações comerciais com capacidade biocida: Decis®, um inseticida que tem a deltametrina como base da sua composição química, e Roundup®, um herbicida, com glifosato como princípio ativo, representando desta forma duas classes de pesticidas com vasta utilização. Concretamente, o presente estudo delineou-se de forma a responder aos seguintes objetivos: (i) a avaliação do potencial de indução de lesões cromossómicas pelo Decis®, (ii) a capacidade do Roundup® na indução de dano no ADN, (iii) o envolvimento de processos de dano oxidativo na perda de integridade do ADN assim como (iv) a participação dos processos de reparação do ADN na progressão do dano induzido pelo Roundup®. Adotou-se a enguia europeia (Anguilla Anguilla L.) como organismo-teste, submetendo-a a concentrações ambientalmente realistas de Decis® e Roundup® durante exposições de curta duração (3 dias), seguidas por avaliações de pós-exposição de 1, 7 e 14 dias como forma de avaliar a evolução do dano após a cessação da exposição. O dano genotóxico induzido pelo Decis® foi avaliado adotando o teste das anomalias nucleares eritrocíticas (ANE), através do qual se podem observar lesões cromossómicas sinalizando um tipo de dano de difícil reparação. A genotoxicidade do Roundup® foi determinada utilizando o ensaio do cometa que deteta quebras no ADN, sendo este tipo de dano suscetível de ser reparado. Com o intuito de esclarecer o envolvimento de processos oxidativos na genotoxicidade deste herbicida, o ensaio do cometa foi melhorado com uma etapa adicional, através da qual a incubação com enzimas de reparação, as endonucleases FPG e EndoIII, permite a deteção de purinas e pirimidinas oxidadas, respetivamente. A aplicação do ensaio da reparação por excisão de bases (REB) permitiu avaliar a capacidade de reparação de dano oxidativo no ADN em enguias expostas in vivo a Roundup®. No geral, os pesticidas Decis® e Roundup® mostraram ser genotóxicos para A. anguilla, tendo em conta a deteção de dano citogenético e no ADN, respetivamente. Além disso, em ambos os casos a genotoxicidade mostrou ser de natureza temporária, uma vez que os peixes demonstraram a capacidade de reverter completamente as lesões previamente induzidas. A exposição ao inseticida Decis® levou ao aumento da frequência de ANE, como resultado das suas propriedades clastogénica e/ou aneugénica. Este parâmetro assumiu níveis semelhantes aos medidos nos indivíduos do grupo controlo 7 dias após a cessação da exposição ao contaminante. A recuperação do dano citogenético parece resultar de uma remoção preferencial das células com morfologia nuclear anómala, tendo em conta que não se observaram alterações na dinâmica eritropoética. O herbicida Roundup® confirmou a sua capacidade de induzir dano no ADN de células hepáticas e, apesar de não se refletir num aumento de quebras resultantes dos sítios sensíveis à FPG e à EndoIII, o envolvimento dos processos oxidativos foi confirmado. O dano no ADN de enguias expostas a este agroquímico deixou de ser percetível 1 dia após a cessação da exposição, demonstrando ser um tipo de dano de fácil reparação. As enzimas de reparação de ADN revelaram ser vulneráveis a pressões inibitórias associadas a elevados níveis de Roundup® (constituintes e/ou metabolitos) e/ou espécies reativas de oxigénio (ERO) que provavelmente ocorrem no fígado durante o período de exposição. Contudo, no período de pós-exposição, observou-se um aumento da reparação do dano oxidativo no ADN, tornando-se deste modo, uma importante via para a recuperação completa do dano genético. No que diz respeito às metodologias adotadas na concretização da presente tese (teste das ANE e técnica do cometa), ambas revelaram ser adequadas enquanto ferramentas de deteção dos tipos de dano descritos, confirmando a relevância da sua aplicação na avaliação do risco genotóxico de contaminantes em peixes. Tendo em conta a especificidade dos tipos de dano genético associados a cada uma das técnicas, a sua utilização complementar deverá ser considerada como uma mais-valia em diferentes momentos, considerando períodos de exposição/pós-exposição. Globalmente, os resultados obtidos através deste trabalho indicaram que as comunidades aquáticas expostas a pesticidas se encontram sob risco, no que concerne à sua integridade genómica. Neste sentido, os dados obtidos apontam ainda para a necessidade de incrementar o número de estudos de avaliação do risco ambiental para as ictiopopulações. Deve ainda ser investigado o impacte de exposições curtas de pesticidas, tendo em conta a capacidade dos peixes recuperarem rapidamente dos efeitos causados a curto prazo. Neste sentido, é importante estabelecer medidas rigorosas que apontem para a diminuição da utilização de pesticidas e de comportamentos negligentes, assim como conduzir à escolha de compostos menos tóxicos.
Description: Mestrado em Biologia Aplicada
URI: http://hdl.handle.net/10773/13763
Appears in Collections:DBio - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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