Challenges of ethanol production from lignocellulosic biomass

Abstract

The present work aimed to tackle two of the major challenges in bioethanol production from lignocellulosic feedstocks: (i) high tolerance of microorganisms to lignocellulosic inhibitors, and (ii) microbial contamination avoidance. Lignocellulosic inhibitors are an important fraction of spent sulphite liquor (SSL), a by-product of the pulp and paper industries. Hardwood SSL (HSSL) is rich in pentose sugars, mainly xylose, which can be converted to ethanol by the yeast Scheffersomyces stipitis. In this work, a population of S. stipitis previously adapted to 60 % (v/v) of HSSL was used, and its stability on the absence of inhibitors during ten sequential transfers was investigated at single-clone level. During the screening trials, all the isolated clones showed higher xylose and acetate uptake rates and lower ethanol productivities than the parental strain. The clone exhibiting higher xylose uptake rate (0.558 g L-1 h-1) was named isolate C4. The effect of short-term adaptation on isolate C4 fermentation performance was evaluated by pre-cultivating the clone in the presence or absence of 60 % (v/v) of HSSL. The uptake rates of glucose and xylose were similar under both conditions, but a higher acetate consumption rate (0.101 g L-1 h-1) and maximum ethanol concentration (4.51 g L-1) were achieved without pre-adaptation step, suggesting the robustness of isolate C4. The industrial bioethanol production is mostly carried out under non-sterile conditions, which favours microbial contamination. In this work, the mechanism that triggers Lactobacillus pentosus contamination in SSL plants was investigated. A simulated synthetic hydrolysate mimicking the average composition of sugars and inhibitors of softwood SSL (SSSL) was used and the impact of different factors in bacterial and Saccharomyces cerevisiae viability was analysed. The presence of yeast extract led to an increase in lactate production (9-fold higher) and L. pentosus viability when only bacteria was inoculated. Using different inoculation ratios of yeast/bacteria, the ethanol production rates were not affected after 48 h, and L. pentosus failed to overtake S. cerevisiae. The presence of inhibitors delayed yeast growth, but the bacteria did not outcompete S. cerevisiae. When the pH was optimal to L. pentosus in co-culture experiments, the bacterial cell viability decreased slower. The results indicate that L. pentosus was unable to overtake S. cerevisiae. The presence of yeast extract and favourable pH to bacteria are important factors that can play a role in the mechanism that triggers the bacterial contamination in ethanol plants.

A presente dissertação tem como objetivo abordar dois dos maiores desafios na produção de bioetanol a partir de biomassa lenhocelulósica: (i) elevada tolerância de microrganismos a inibidores, e (ii) prevenção de contaminação microbiana. Os inibidores lenhocelulósicos são uma fração relevante do licor de cozimento ao sulfito ácido (SSL), um subproduto das indústrias do papel e pastas. O SSL de folhosas (HSSL) é rico em pentoses, principalmente xilose, que podem ser fermentadas em etanol pela levedura Scheffersomyces stipitis. Neste estudo, utilizou-se uma população de S. stipitis previamente adaptada a 60 % (v/v) HSSL, e avaliou-se a sua estabilidade na ausência de inibidores durante dez transferências sequenciais. Comparando com a estirpe original, todos os clones isolados exibiram taxas de consumo de xilose e ácido acético superiores e produtividades em etanol inferiores. O clone que demonstrou a maior taxa de consumo de xilose (0,558 g L-1 h-1) foi designado isolado C4, e o efeito de adaptação de curta duração no seu desempenho fermentativo foi investigado através do seu pré-cultivo na presença ou ausência de 60 % (v/v) HSSL. Nas duas condições, as taxas de consumo de glucose e xilose foram idênticas, contudo, atingiu-se maior taxa de consumo de ácido acético (0,101 g L-1 h-1) e maior concentração máxima de etanol (4,51 g L-1) foram atingidas na ausência do processo de adaptação de curta duração. Tais resultados demonstram a robustez do isolado C4. A maioria dos processos de produção industrial de bioetanol é realizada na ausência de esterilidade, favorencendo a contaminação por microrganismos. Neste estudo, investigou-se o mecanismo responsável pela contaminação com Lactobacillus pentosus na indústria de SSL. Para tal, utilizou-se um hidrolisado sintético mimetizando a composição média de açúcares e inibidores de SSL de resinosas (SSSL) e averiguou-se o impacto de vários fatores na viabilidade de L. pentosus e S. cerevisiae. A presença de extrato de levedura foi responsável pelo aumento da produção de ácido lático (9 vezes) e da viabilidade bacteriana quando L. pentosus foi cultivado na ausência de levedura. Diferentes proporções de inóculo de levedura/bactéria não afetaram a produção de etanol após 48 h de fermentação, e L. pentosus foi incapaz de ser a estirpe dominante durante os ensaios de co-cultura. A presença de inibidores retardou o crescimento da levedura, mas a bactéria foi de novo incapaz de se a espécie dominante. Ajustando o valor de pH para o ótimo de L. pentosus nos ensaios de co-cultura, a viabilidade celular da bactéria diminuiu mais lentamente. Os resultados demonstram que L. pentosus não foi a espécie dominante nos ensaios de co-cultura. A presença de extrato de levedura e de valores de pH favoráveis a L. pentosus podem desempenhar um papel importante no mecanismo responsável pela contaminação bacteriana nas indústrias de produção de bioetanol.