Phage therapy in aquaculture : use of phage cocktails and lysozyme

Abstract

Aquaculture is one of the fastest growing food industry sectors in the world in recent years. However, the appearance of pathogenic microorganisms, including multirresistant bacteria, and their dissemination in the environment has become a problem for the aquaculture industry. This means that it is necessary to develop less harmful strategies to the environment to allow a sustainable growth of the aquaculture systems. Phage therapy emerges as a potential alternative to inactivate pathogenic bacteria in aquaculture. The main objective of this study was to assess the efficacy of phage therapy to inactivate fish pathogenic bacteria. The use of phage cocktails and lysozyme was also evaluated on the efficiency of phage therapy. The phage therapy assays were performed with the bacterium Vibrio parahaemolyticus and with three phages produced on this bacterium (VP-1, VP-2 and VP-3). The dynamics of phage-bacteria interaction was characterized in Tryptic Soy Broth through host and phage quantification, respectively by pour plate and by the double-layer agar technique. The three phages were tested alone and in cocktails of two or three phages. The efficiency of the bacterial inactivation by the phages was tested at different lysozyme concentrations (range 0.8 μg mL-1 to 20 mg mL-1). As the selection of bacteriophages is a key factor for the success of phage therapy, the host range, their survival in aquaculture water, as well as the burst size and the explosion time, were determined. The cross-infection was used to determine the phage host range. To determine the survival of the phages in marine water, the double-layer agar technique was used. The burst size and the explosion time were calculated by the one-step growth curve analysis. The use of cocktails of two and three phages was significantly more effective (reduction of 4 log at 2 h of treatment) than the use of the VP-1, VP-2 and VP-3 phages alone (reductions of about 0.6, 0.8 and 2.6 log, at 2 h of treatment respectively for the VP-1, VP-2, and VP-3 phages). The combination of phage plus lysozyme showed a better inhibitory activity when compared with the activity of the phage alone. The VP-1 and VP-2 phages were more efficient to inactivate the Vibrio (reduction of about 4 log after 6 - 8 h treatment), in the presence of high concentrations of lysozyme, than the VP-3 phage. However, the VP-3 phage was more efficient in the presence of low concentrations of lysozyme (reduction of 3.2 log after 2 h of incubation). The results of the cross-infection showed that the phages of Vibrio parahaemolyticus also infect Vibrio anguillarum and Aeromonas salmonicida with high efficiency. The assays of phage survival in aquaculture water showed that the phages remain viable for long time periods (more than 5 - 7 months). The VP-3 phage presented a higher burst size and a shorter latent period (42 and 40 min, respectively) than the other two phages (9 and 15 and 120 min and 90 min, respectively, for the VP-1 and VP-2 phages). In conclusion, the use of phage cocktails appears to be an effective approach to treat vibriosis. Bacterial inactivation is more efficient and occurs earlier when the phage cocktails are used, but their use in vitro does not prevent bacterial regrowth after treatment. However, the use of phage cocktails retarded the regrowth of the bacteria. The application of phages with lysozyme to eliminate or reduce fish pathogenic bacteria in aquaculture can be a promising strategy, namely when less effective phages are available. Besides, the use of phages with a high burst size and a short latent period clearly increase the efficiency of phage therapy.

A aquacultura é um dos setores da área alimentar que mais tem crescido nos últimos anos. No entanto, o aparecimento de microrganismos patogénicos, incluindo bactérias multirresistentes, e a sua disseminação no meio ambiente tornou-se um problema para a indústria de aquacultura. Este facto leva a que seja necessário o desenvolvimento de estratégias menos lesivas para o ambiente de forma a permitir o crescimento sustentável da aquacultura. A terapia fágica surge como uma alternativa potencialmente viável e eficaz para inativar bactérias patogénicas em aquacultura. O principal objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da eficácia da terapia fágica para inativar bactérias patogénicas de peixes. Foi avaliado o efeito do uso de cocktails de fagos e de lisozima na eficiência da terapia fágica. Os ensaios de terapia fágica foram realizados com a bactéria Vibrio parahaemolyticus e com três fagos produzidos sobre esta bactéria (VP-1, VP-2 e VP-3). A dinâmica de interação fago-bactéria foi caracterizada em meio de cultura Tryptic Soy Broth através da quantificação do hospedeiro por incorporação e da quantificação dos fagos pela técnica da dupla camada de agar. Os três fagos foram testados isoladamente e em cocktails de dois ou três fagos. A eficiência de inactivação bacteriana pelos três fagos foi testada com diferentes concentrações de lisozima (gama 0,8 μg mL-1 a 20 mg mL-1). Como, para aplicar com sucesso a terapia fágica, é importante ter informação sobre as características dos fagos, a gama de hospedeiros, a sua sobrevivência na água da aquacultura, bem como o seu número e tempo de explosão, foram determinados. Para o estudo da gama de hospedeiros de bacteriófagos usou-se a infeção cruzada. Para determinar a sobrevivência dos fagos na água marinha foi usada a técnica da dupla camada de agar. O número e o tempo de explosão foram determinados através da determinação das curvas de crescimento síncrono. O uso de cocktails de dois e três fagos foi significativamente mais eficaz (redução de 4 log após 2 h de tratamento) do que o uso dos fagos VP-1, VP-2 e VP-3 sozinhos (redução 0,6, 0,8, e 2,6 log para os fagos VP-1, VP-2 e VP-3, respectivamente, após 2 h de tratamento). A combinação de lisozima e fago apresentou melhor atividade inibidora em comparação com a atividade do fago sozinho. Os fagos VP-1 e VP-2 foram mais eficazes na inativação bacteriana (redução de cerca 4 log após 6 - 8 h de tratamento) na presença de altas concentrações de lisozima do que o fago VP-3. No entanto, o fago VP-3 foi mais eficaz na presença de baixas concentrações de lisozima (redução de 3,2 log, depois de 2 h de tratamento). Os resultados da infeção cruzada mostraram que os fagos de Vibrio parahaemolyticus inoculados noutras bactérias infetaram também Vibrio anguillarum e Aeromonas salmonicida, apresentando uma eficiência de infeção elevada. Os ensaios de sobrevivência dos fagos na água de aquacultura mostraram que estes permanecem viáveis por longos períodos de tempo (mais de 5 - 7 meses). O fago VP-3 apresentou um número de explosão maior e um período latente menor (42 e 40 min, respetivamente), do que os outros dois fagos (9 e 120 min e 15 e 90 min, respetivamente, para o fago VP-1 e VP-2). Em conclusão, a utilização de cocktails de fagos parece ser uma abordagem eficaz para o tratamento de vibrioses. A inativação bacteriana é mais eficiente e ocorre mais cedo quando são usados os cocktails de fagos, mas a sua utilização in vitro não impede o recrescimento bacteriano após o tratamento, retardando, no entanto, o recrescimento da bactéria. A aplicação de fagos com lisozima, para eliminar ou reduzir bactérias patogénicas de peixes em aquacultura, pode ser uma estratégia promissora, nomeadamente quando os fagos disponíveis são menos eficientes. A utilização de fagos com um alto número de explosão e um período latente curto aumenta claramente a eficiência da terapia fágica.