Pregnancy and newborns disorders followed by urine metabolomics

Abstract

Chapter 1 introduces the scope of the work by identifying the clinically relevant prenatal disorders and presently available diagnostic methods. The methodology followed in this work is presented, along with a brief account of the principles of the analytical and statistical tools employed. A thorough description of the state of the art of metabolomics in prenatal research concludes the chapter, highlighting the merit of this novel strategy to identify robust disease biomarkers. The scarce use of maternal and newborn urine in previous reports enlightens the relevance of this work. Chapter 2 presents a description of all the experimental details involved in the work performed, comprising sampling, sample collection and preparation issues, data acquisition protocols and data analysis procedures. The proton Nuclear Magnetic Resonance (NMR) characterization of maternal urine composition in healthy pregnancies is presented in Chapter 3. The urinary metabolic profile characteristic of each pregnancy trimester was defined and a 21-metabolite signature found descriptive of the metabolic adaptations occurring throughout pregnancy. 8 metabolites were found, for the first time to our knowledge, to vary in connection to pregnancy, while known metabolic effects were confirmed. This chapter includes a study of the effects of non-fasting (used in this work) as a possible confounder. Chapter 4 describes the metabolomic study of 2nd trimester maternal urine for the diagnosis of fetal disorders and prediction of later-developing complications. This was achieved by applying a novel variable selection method developed in the context of this work. It was found that fetal malformations (FM) (and, specifically those of the central nervous system, CNS) and chromosomal disorders (CD) (and, specifically, trisomy 21, T21) are accompanied by changes in energy, amino acids, lipids and nucleotides metabolic pathways, with CD causing a further deregulation in sugars metabolism, urea cycle and/or creatinine biosynthesis. Multivariate analysis models´ validation revealed classification rates (CR) of 84% for FM (87%, CNS) and 85% for CD (94%, T21). For later-diagnosed preterm delivery (PTD), preeclampsia (PE) and intrauterine growth restriction (IUGR), it is found that urinary NMR profiles have early predictive value, with CRs ranging from 84% for PTD (11-20 gestational weeks, g.w., prior to diagnosis), 94% for PE (18-24 g.w. pre-diagnosis) and 94% for IUGR (2-22 g.w. pre-diagnosis). This chapter includes results obtained for an ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) study of pre-PTD samples and correlation with NMR data. One possible marker was detected, although its identification was not possible. Chapter 5 relates to the NMR metabolomic study of gestational diabetes mellitus (GDM), establishing a potentially predictive urinary metabolic profile for GDM, 2-21 g.w. prior to diagnosis (CR 83%). Furthermore, the NMR spectrum was shown to carry information on individual phenotypes, able to predict future insulin treatment requirement (CR 94%). Chapter 6 describes results that demonstrate the impact of delivery mode (CR 88%) and gender (CR 76%) on newborn urinary profile. It was also found that newborn prematurity, respiratory depression, large for gestational age growth and malformations induce relevant metabolic perturbations (CR 82-92%), as well as maternal conditions, namely GDM (CR 82%) and maternal psychiatric disorders (CR 91%). Finally, the main conclusions of this thesis are presented in Chapter 7, highlighting the value of maternal or newborn urine metabolomics for pregnancy monitoring and disease prediction, towards the development of new early and non-invasive diagnostic methods.

O Capítulo 1 descreve o enquadramento deste trabalho identificando as doenças pré-natais relevantes e os métodos de diagnóstico actualmente disponíveis. É depois apresentada a metodologia seguida, assim como uma breve introdução dos princípios dos métodos analíticos e estatísticos aplicados. O capítulo é concluído com uma descrição do estado da arte na área de metabolómica em investigação pré-natal, identificando o mérito desta inovadora estratégia para a identificação de marcadores robustos de doenças pré-natais. A relevância deste trabalho torna-se clara através do escasso uso de urina materna e do recém-nascido em trabalhos anteriores. O Capítulo 2 descreve os procedimentos experimentais utilizados neste trabalho, incluindo condições de amostragem, recolha e preparação das amostras, protocolos de aquisição e de tratamento dos dados. A caracterização da composição da urina materna, através de espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de protão é apresentada no Capítulo 3. Define-se o perfil metabólico urinário característico para cada trimestre de gravidez, tendo sido encontrado um conjunto de 21 metabolitos descritivo das alterações metabólicas ocorridas ao longo da gravidez. 8 metabolitos foram encontrados a variar com a gravidez, pela primeira vez, tendo sido confirmadas variações metabólicas conhecidas. É ainda estudado o efeito do não-jejum (usado neste trabalho) como possível factor de confusão. O Capítulo 4 apresenta o estudo metabolómico de urina materna do 2º trimestre para o diagnóstico de doenças fetais e previsão de complicações mais tarde desenvolvidas. Este estudo compreende a aplicação de um método de selecção de variáveis desenvolvido no âmbito desta tese. Observou-se que as malformações fetais (e, especificamente, do sistema nervoso central, SNC) e as cromossomopatias (e, especificamente, a trissomia 21, T21) são acompanhadas por alterações nos metabolismos energético, dos aminoácidos, lípidos e nucleótidos, enquanto que as cromossomopatias mostraram ser acompanhadas por uma desregulação adicional dos metabolismos dos açúcares, ciclo da ureia e/ou biossíntese da creatinina. A validação dos modelos multivariados revelou taxas de classificação (CR) de 84% para malformações (87%, SNC) e 85% para CD (94%, T21). Para o parto pré-termo, pré-eclampsia (PE) e restrição de crescimento intrauterino (RCIU) observaram-se perfis que podem ajudar à previsão precoce, com CR 84% para pretermo (11-20 semanas de gestação, g.w. pré-diagnóstico), 94% para PE (18-24 g.w. pré-diagnóstico) e 94% para RCIU (2-22 g.w. pré-diagnóstico). Este capítulo inclui resultados obtidos por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massa (UPLC-MS) para pré-pretermo e correlação com os dados de RMN. Um possível composto marcador foi detectado mas a sua identificação não foi possível. O Capítulo 5 descreve o estudo metabolómico por RMN da diabetes mellitus gestacional (DMG), estabelecendo-se um perfil metabólico potencialmente preditivo da doença (CR 83%, 2-21 g.w. pré-diagnóstico). Verificou-se ainda que o espectro de RMN contém informação sobre o fenótipo individual, capaz de prever a necessidade futura de tratamento com insulina (CR 94%). No Capítulo 6 demonstra-se o impacto do tipo de parto (CR 88%) e género do bebé (CR 76%) no perfil da urina do recém-nascido. Verificou-se ainda que a prematuridade, depressão respiratória, crescimento grande para a idade gestacional e malformações induzem perturbações metabólicas relevantes (CR 82-92%), assim como algumas doenças maternas como a DMG (CR 82%) e doenças psiquiátricas (91% CR). Finalmente, no Capítulo 7 apresentam-se as principais conclusões deste trabalho, enfatizando o potencial da metabolómica de urina materna e do bebé para o acompanhamento da gravidez e previsão de doenças, visando o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico precoce e não-invasivo.