Molecular screening of Hepatozoon in amphibian hosts

Abstract

Parasite diversity has been poorly studied due to several factors, like the size of some species, location within the host, and the focus on groups with strong anthropogenic interests or with significant economic impact. Apicomplexa is a vast and diverse group of unicellular parasites with wide distribution and the most successful pathogen known to man. Within the group some genus have received little attention, like the case of Hepatozoon. They are poorly studied organisms requiring more sampling. Molecular screening techniques like PCR are quick and easy to use, and allow efficient detection of these parasites. It also allows sequencing which produce data for phylogenetic analyses. Nonetheless more data is necessary to correctly establish taxonomy and phylogenetic relations of the group. The aim of this work was to assess the diversity of parasites trough screening of tissue and blood samples from different amphibian species using specific parasite primers and reconstruct the phylogenetic relationships of the sequences produced. Several species of amphibians from Iberian Peninsula, Mediterranean Islands, Macaronesia region and Morocco were analyzed using specific parasite primers and blood smears were observed. Parasites were observed in several slides, with at least two Hepatozoon being identified, however primers fail to detect them. Only two parasites were amplified, a protozoan parasite, Ichthyopthirius multifiliis, identified in a Bufo calamita sample from Portugal, and a Apicomplexa parasite, Dactylosoma ranarum, in Pelophylax saharicus from Morocco. The primers used seem not to be useful with amphibians and new primers need to be developed to correctly assess the identity of the parasites observed In the smears.

A diversidade de parasitas tem sido pouco estudada devido a vários fatores, como o tamanho de algumas espécies, a localização dentro do hospedeiro, e o foco em grupos com fortes interesses antropogénicos ou com impacto econômico significativo. Apicomplexa é um grupo grande e diverso de parasitas unicelulares e com uma ampla distribuição e é o agente patogénico com mais sucesso conhecido pelo homem. Dentro do grupo alguns gêneros têm recebido pouca atenção, como caso de Hepatozoon. Estes são organismos pouco estudados que requerem mais amostragem. Técnicas de rastreio molecular, como PCR, são rápidas e fáceis de usar, e permitem a deteção eficiente desses parasitas. Elas também permitem a sequenciação produzindo dados para análises filogenéticas. Contudo mais dados são necessários para determinar corretamente a taxonomia e as relações filogenéticas do grupo. O objetivo deste trabalho foi detetar a diversidade de parasitas através de screening de amostras de tecido e sangue de diferentes espécies de anfíbios, utilizando primers específicos e reconstruir as relações filogenéticas das sequências produzidas. Várias espécies de anfíbios da Península Ibérica, Ilhas do Mediterrâneo, região Macaronésia e Marrocos foram analisadas usando primers específicos para parasitas e esfregaços de sangue foram observados. Parasitas foram encontrados em vários slides, sendo possível a identificação de pelo menos dois Hepatozoon, no entanto os primers não foram capazes de detetar as infeções. Apenas dois parasitas foram amplificados atráves de primers Hep, um parasita protozoário, Ichthyopthirius multifiliis, identificado numa amostra de Bufo calamita de Portugal, e um parasita Apicomplexa, Dactylosoma ranarum, em Pelophylax saharicus de Marrocos. Os primers utilizados não parecem ser úteis com anfíbios e novos primers precisam ser desenvolvidos para corretamente identificar a identidade dos parasitas observados nos slides.