Diversity of the cutaneous bacterial community in the Perez’ frog

Abstract

Amphibian skin holds a resident bacterial community in the skin surface may confer amphibian species tolerance to environmental stressors. Exposure to chemical contamination may cause direct effects to the amphibians but, simultaneously, may reduce skin bacterial diversity and consequently alter the sensitivity of amphibians to future environmental stressors. Understanding the structure, dynamics and specificity of this microbial community is needed to engage a better and broader protection of amphibians. Accordingly, the present study aimed at investigating the skin-associated bacterial community of the Perez´s frog Pelophylax perezi (Seoane) looking at among and within population variation. To attain this main goal the outer microbiome of the frogs were characterize by culture independent method (PCR/DGGE) and assessing the cultivable portion of bacteria. Furthermore, to evaluate the effects caused by exposure to chemical contamination in the skin bacterial community, some bacterial isolates were exposed to a rich metal contaminated effluent. Skin swabs for sampling symbiotic skin bacteria were collected from 28 amphibian individuals from five different ponds, one of them a metal-rich contaminated effluent (Ribeira da Agua Forte, Aljustrel). For each sampling site physical and chemical characterization of water samples was carried out. A culture independent method showed a characteristic profile in frogs from contaminated site and that both intra- and inter-population variability exist in amphibian skin microbiome. Assessing the cultivable portion of bacteria, microbial concentration per amphibian varied within animals from the same environment and between animals from different environments. Results revealed low diversity and bacterial density (CFU/ frog swab sample) on individuals from metal contaminated site. Isolated bacteria were genetically identified based on 16S rRNA gene sequence. Ecotoxicological assays exposing 30 bacterial isolates to the metal contaminated effluent showed that the percentage of resistant isolates was higher in frogs from the contaminated site. It was also observed that those bacteria exposed to effluent presented a delay in their growth rate.

A pele de alguns anfíbios possui uma comunidade bacteriana residente que pode conferir tolerância a stress ambiental. A contaminação química pode causar efeitos adversos diretos em anfíbios, mas ao mesmo tempo pode reduzir a diversidade bacteriana da pele e, consequentemente, alterar a sensibilidade destes organismos a futuras perturbações ambientais. Compreender a estrutura, dinâmica e especificidade desta comunidade microbiana é necessário para desenvolver uma melhor e mais ampla proteção deste grupo de organismos. Assim, o presente estudo teve como objetivo geral investigar a comunidade bacteriana associada à pele da rã verde comum Pelophylax perezi (Seoane) através da análise da variação intra- e inter populacional. Para alcançar este objetivo o microbioma exterior das rãs foi caracterizado pelo método independente de cultura (PCR / DGGE) e avaliada também a parte cultivável de bactérias. Além disso, para avaliar os efeitos causados pela exposição a contaminação química na comunidade bacteriana da pele, 30 isolados bacterianos foram expostos a um efluente ácido e rico em metais. As zaragatoas para amostrar as bactérias simbióticas da pele dos anfíbios foram recolhidas em 28 indivíduos de cinco locais diferentes, um deles impactado por um efluente ácido e rico em metais (Ribeira da Água Forte, Aljustrel). Para cada local de amostragem foi realizada a caracterização físico-química de amostras de água. O método independente de cultura mostrou um perfil característico de rãs do local contaminado e que a variabilidade tanto intra- e inter- populacional existe no microbioma da pele da rã P. perezi, no entanto, a última parece ser maior do que o anterior. Avaliando a porção cultivável de bactérias, a concentração microbiana por anfíbio varia entre animais do mesmo meio e entre os animais de diferentes ambientes. Os resultados revelaram uma baixa diversidade e densidade de bactérias (UFC / zaragatoa) em indivíduos que habitam o local contaminado por metais. As bactérias isoladas foram geneticamente identificadas com base na sequência do gene de rRNA 16S. O ensaio ecotoxicológico de exposição de isolados bacterianos ao efluente ácido e rico em metais mostrou que a percentagem de isolados resistentes foi maior em isolados provenientes de animais da área impactada pelo efluente. Foi ainda observado que isolados bacterianos quando expostos ao efluente têm um atraso na sua taxa de crescimento comparativamente ao controlo.