Efeito da carga do fotossensibilizador em lípidos de Escherichia coli

Abstract

A inativação fotodinâmica (PDI) é um método simples e eficaz para destruir microrganismos. Esta tecnologia baseia-se na administração de um fotossensibilizador (FS), normalmente uma porfirina ou derivados de ftalocianina, que é preferencialmente acumulado nas células microbianas. A posterior irradiação com luz visível, na presença de oxigénio, conduz à formação de espécies citotóxicas, particularmente espécies reativas de oxigénio (ROS), tais como radicais livres e oxigénio singuleto, que causam danos celulares específicos e levam à inativação do microrganismo. Os principais alvos de PDI são as estruturas microbianas externas, como as paredes e membranas celulares. O conhecimento de como estes alvos moleculares são afetados assume uma grande importância para melhor compreender o processo de fotoinativação. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito causado por cinco derivados porfirínicos com diferente distribuição de carga durante o processo de fotoinativação em lípidos membranares de Escherichia coli. O efeito foi avaliado por quantificação de hidroperóxidos lipídicos e por análise da variação do perfil de ácidos gordos. Culturas de E. coli foram irradiadas com luz branca na presença de cada um dos fotossensibilizadores (5.0 μM) durante 90 e 270 minutos. Após o ensaio de fotoinativação os lípidos membranares foram extraídos e quantificados através do ensaio de fósforo. Os hidroperóxidos presentes nos extratos lipídicos totais foram quantificados através de FOX2 (ferrous oxidation-xylenol orange) e o perfil de ácidos gordos foi adquirido por cromatografia gasosa com detetor de ionização em chama (GC-FID). Após PDI, foi observado a formação de hidroperóxidos com qualquer um dos fotossensibilizadores. A análise do perfil de ácidos gordos mostrou uma diminuição dos ácidos gordos insaturados que dependeu diretamente da distribuição de carga na porfirina. O fotossensibilizador que induziu a maior diminuição de ácidos gordos insaturados foi o que apresentou uma maior taxa de inativação. Uma vez provado que os lípidos da membrana bacteriana são afetados durante PDI, foi também avaliado o efeito dos mesmos fotossensiblizadores em sistemas modelo utilizando lipossomas de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. A oxidação lipídica foi avaliada por espectrometria de massa com ionização por electrospray (ESI-MS). Foram adquiridos espectros de MS para todos os sensibilizadores em diversos tempos e concentrações para avaliar o efeito destas duas variáveis no processo de fotoinativação. Concluiu-se que os fosfolípidos das membranas bacterianas são importantes alvos moleculares de fotoinativação sendo a formação de hidroperóxidos um bom indicador deste processo.

Photodynamic inactivation (PDI) is a simple and controllable method to destroy microorganisms based on the production of reactive oxygen species (ROS) (e.g. free radicals and singlet oxygen), which irreversibly oxidize microorganism’s vital constituents resulting in lethal damage. This technology requires the combined action of oxygen, light and a sensitizer (FS), which absorbs and uses the energy from light to produce those ROS. The main targets of the antibacterial photodynamic activity are the external microbial structures, as cell walls and cell membranes. For a better understanding of photoinactivation process, the knowledge of how some molecular targets are affected by PDI assumes a great importance. The aim of this work was to study the effect caused by positive charged porphyrin derivatives, used as FS, during photoinactivation process on Escherichia coli lipids. In this context, the effect of five porphyrin derivatives, bearing one to four positive charge was evaluated by the quantification of lipid hydroperoxides and by analysis of the variation of fatty acyl profiling. E. coli suspensions were irradiated with white light in the presence of each FS (5.0 μM) and non-photosensitized bacteria were used as dark (with FS and without light) and light (irradiated without FS) controls. After PDI, the total lipids were extracted and quantified by phosphorus assay. Lipid oxidation was quantified by ferrous oxidation in xylenol orange (FOX2) assay and the fatty acyl profiling analysis was done by gas chromatography (GC). After PDI, it was observed an overall increase in the lipid hydroperoxides contents depending to the FS charge and its distribution on the macrocycle. The pattern of lipid oxidation had a high correlation with photoinactivation effectiveness of the five cationic porphyrins. In fact the FS that induced higher lipid oxidation was the one that corresponded to higher bacterial inactivation. Analysis of fatty acyl profile by GC showed a decrease in the unsaturated fatty acids, corroborate the relationship between lipid oxidation and photoinactivation. It was also evaluated the same sensitizers effects on the standard 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine. The oxidation of lipid was assessed by mass spectrometry with electrospray ionization (ESI-MS). MS spectra were acquired for all photosensitises in separated systems at different times and concentrations to evaluate the effect of these two variables in efficiency of the photoinactivation. It can be concluded that bacterial membrane phospholipids are important molecular targets of photoinactivation being the formation of hydroperoxy derivatives a good indicator of the process.