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Title: Efeito fotodinâmico nos ácidos nucleicos de E. coli
Author: Coimbra, Sónia Isabel dos Santos
Advisor: Almeida, Adelaide de
Faustino, Maria do Amparo Ferreira
Keywords: Biotecnologia molecular
Terapia fotodinâmica
Porfirinas
Electroforese
Defense Date: 6-Mar-2014
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: O aumento do número de microrganismos resistentes a antibióticos constitui uma das grandes problemáticas da atualidade, tornando-se pertinente encontrar terapias alternativas de tratamento de doenças infeciosas. A inativação fotodinâmica (PDI) tem sido proposta como alternativa para o controlo de infeções. A PDI consiste na destruição de microrganismos através da interação entre três componentes: luz, uma molécula de fotossensibilizador e oxigénio na forma molecular. Apesar de existirem numerosos estudos que demonstram a eficiência da PDI em diferentes tipos de microrganismos e com recurso a diferentes fotossensibilizadores, o mecanismo de PDI, ainda não se encontra completamente compreendido, principalmente no que diz respeito ao dano causado no DNA. De um modo geral, são considerados dois mecanismos principais, propostos para os efeitos letais causados nas bactérias pelo processo de PDI: este processo pode produzir alterações na parede celular ou provocar danos no DNA, sendo que os danos na parede celular são, de um modo geral, referidos como os principais responsáveis pela inativação celular. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito fotodinâmico nos ácidos nucleicos de E. coli usando como fotossensibilizadores duas porfirinas catiónicas, a tetra-iodeto de 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina (Tetra-Py+-Me) e a tri-iodeto de 5,10,15-(1-metilpiridinio-4-il)-20-(pentafluorofenil)porfirina (Tri-Py+-Me-PF). Neste sentido, recorreu-se a duas abordagens metodológicas diferentes. No primeiro caso, procedeu-se à fotoinativação das células de E. coli durante diferentes períodos de tempo e extraíram-se os ácidos nucleicos subsequentemente (efeito indireto). No segundo caso, os ácidos nucleicos foram extraídos de células de E. coli e irradiados posteriormente (efeito direto). Em ambas as abordagens metodológicas, os ácidos nucleicos foram analisados por eletroforese em gel de agarose e quantificados por fluorometria. Em geral, os perfis eletroforéticos dos ácidos nucleicos extraídos das células de E. coli após PDI mostram uma diminuição na quantidade de DNA genómico ao longo do tempo, diretamente proporcional à inativação das células. Com a porfirina Tri-Py+-Me-PF, a diminuição de DNA genómico ocorreu mais rapidamente, comparativamente com a porfirina Tetra-Py+-Me. Relativamente aos perfis eletroforéticos dos ácidos nucleicos extraídos das células de E. coli não irradiadas e posteriormente irradiados na presença do fotossensibilizador, observou-se que não ocorreu variação na quantidade de DNA genómico ao longo do tempo, contudo, observou-se uma diminuição na quantidade de rRNA ao longo do tempo. Embora não tenham sido observados danos no DNA, não se exclui a possibilidade de terem ocorrido danos não detetáveis com a metodologia utilizada neste estudo.
The increase of antibiotic resistance among pathogenic microorganisms is a major public health issue, making it relevant to find alternative therapies for the treatment of infectious diseases. Photodynamic inactivation (PDI) has been proposed as an alternative approach for the treatment of infections. PDI consists in destroying microorganisms through the interaction of three components: light, photosensitizer and molecular oxygen. Although there are numerous studies showing the efficiency of PDI in the inactivation of different types of microorganisms, by different photosensitizers, the mechanism of PDI is not yet fully understood. In general, two main mechanisms are proposed for the lethal effects of PDI on bacterial cells: the PDI process can produce cell membrane damages or cause DNA damage. The damages of the membrane are generally referred to as the main responsible for cell inactivation. The aim of this study was to analyze the photodynamic effect on E. coli nucleic acids, using two cationic porphyrins as photosensitizers (5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridini-um-4-yl)porphyrin tetra-iodide (Tetra-Py+-Me) and 5,10,15-tris(1-methylpyridinium-4-yl)-20-(pentafluorophenyl)porphyrin tri-iodide (Tri-Py+-Me-PF). In this study, we used two different methodological approaches. In the first approach, the E. coli nucleic acids were extracted from photosensitized cells (indirect effect). In the second approach, the nucleic acids were extracted from non-irradiated E. coli cells and irradiated in the presence of the PS (direct effect). In both cases, nucleic acids were analyzed by agarose gel electrophoresis and quantified by fluorometry. In general, the electrophoretic profiles of nucleic acids extracted from E. coli cells after PDI reveal decreases in the amount of genomic DNA over time, which are directly proportional to the cell inactivation. The porphyrin Tri-Py+-Me-PF induced a faster decrease of the genomic DNA over time, in comparison with Tetra-Py+-Me porphyrin. The electrophoretic profiles of nucleic acids of E. coli irradiated in the presence of photosensitizer show no variation in the amount of genomic DNA over time. In this last case, there was a decrease in the amount of rRNA. Although no damage was observed in the DNA, we cannot exclude the possibility of the occurrence of damages which are not detectable by the methodology applied in this study.
Description: Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Molecular
URI: http://hdl.handle.net/10773/12586
Appears in Collections:DQ - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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