DJ-1 mutants binding partners: insights into Parkinson's Disease

Abstract

Parkinson´s disease (PD), the second most common progressive neurodegenerative disorder, is a multifactorial disease caused by both genetic and environmental factors. Among the genes associated with PD, DJ-1 is a multifunctional protein involved in oxidative stress response and neuroprotection. DJ-1 mutations, such as L166P, M26I and E163K lead to loss of protein function causing early onset autosomal recessive PD. Moreover, the residue C106 is considered crucial in DJ-1 function as a sensor of oxidative stress. In this study, one missense mutations (E163K) and two engineered mutations in the residue C106 (C106A and C106DD) were produced and characterized in order to evaluate the neuroprotective effect of each mutation and also characterize their dynamic interactome. Structural analysis confirmed the production of all the mutants in the dimeric form, with a molecular weight of approximately 43kDa. Moreover, protein´s thermal stability was assessed by thermal shift and the results showed that the mutant E163K was the less stable and the C106A the most stable. Secondary structure analysis was performed by circular dichroism and revealed similar secondary structures between DJ-1 WT and mutants. In addition, a LC-MS/MS was performed to determine proteins´ contaminants and the majority of the protein contaminants were coming from the expression system and culture medium used in proteins´ production. Moreover, neuroprotection assays revealed that DJ-1 WT did not protect SH-SY5Y cells under oxidative stress conditions. The dynamic interactome of DJ-1 WT and mutants C106DD, E163K and C106A was characterized under oxidative stress conditions. A wide number of binding partners were identified and for some of them quantification in the different conditions was also determined. These interactors have a broad range of functions but the majority are associated with cellular response to oxidative stress. The study of DJ-1 mutations is very important, since it gives elucidations into DJ-1 WT functions and related disease mechanisms. In this way, the putative DJ-1 WT interactors identified still lack validation, but from these characterized dynamic interactomes further elucidations can be obtained into Parkinson’s Disease pathology and potential new targets for PD prevention and therapy, like ATP-dependent RNA helicase DDX3X herein identified as new dynamic interactor of DJ-1.

A Doença de Parkinson, a segunda doença neurodegenerativa progressiva mais comum, é uma doença multifatorial causada conjuntamente por fatores genéticos e fatores ambientais. De entre os inúmeros genes associados à Doença de Parkinson, a DJ-1 é uma proteína multifuncional envolvida na resposta ao stress oxidativo e neuroproteção. Mutações na DJ-1, tais como L166P, M26I e E136K levam à perda de função da proteína causando a forma de Parkinson autossomal recessiva com desenvolvimento precoce. De salientar que o resíduo C106 é considerado crucial na função de sensor de stress oxidativo que a DJ-1 desempenha. Neste estudo, foram produzidas e caracterizadas duas mutações sintéticas no resíduo C106 (C106A e C106DD) e uma mutação natural (E163K) de modo a avaliar o efeito neuroprotetor de cada mutação bem como caracterizar o seu interactoma dinâmico. Análises estruturais confirmaram a produção de todos os mutantes na forma dimérica, apresentando um peso molecular de aproximadamente 43kDa. A estabilidade térmica das proteínas foi ainda avaliada por thermal shift e os resultados revelaram que o mutante E163K foi o menos estável enquanto que o mutante C106A foi o mais estável. Análise da estrutura secundária foi realizada por dicroísmo circular revelando elevada semelhança entre as estruturas secundárias da DJ-1 nativa e mutantes. Por fim, foi realizada uma análise de LC-MS/MS de modo a determinar os contaminantes das proteínas produzidas e verificou-se que a maioria dos contaminantes era proveniente do sistema de expressão e meio de cultura utilizados na produção das proteínas. Seguidamente, ensaios de neuroproteção revelaram que a DJ-1 nativa não exercia um efeito neuroprotetor nas células SH-SY5Y em condições de stress oxidativo. O interactoma dinâmico da DJ-1 nativa e mutantes C106DD, E163K e C106A foi caracterizado sob condições de stress oxidativo. Um elevado número de interactores foram identificados e para alguns deles foi possível obter uma quantificação nas diferentes condições. Os referidos interactores apresentam uma enorme variedade de funções, contudo a grande maioria está associada à resposta celular ao stress oxidativo. O estudo das mutações na DJ-1 é considerado muito relevante visto que fornece importantes elucidações relativamente às funções e mecanismos da DJ-1 nativa associados à doença. Neste sentido, os supostos interactores da DJ-1 nativa identificados ainda carecem de validação, mas da caracterização dos interactomas dinâmicos, elucidações podem ser obtidas sobre a patologia da Doença de Parkinson e identificação de novos potenciais alvos para prevenção e terapia desta doença, tal como a RNA helicase DDX3X dependente de ATP aqui identificada como novo interactor dinâmico da DJ-1.