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Title: Síntese e atividade antibacteriana de clorinas e isobacterioclorinas
Author: Mesquita, Mariana Queirós
Advisor: Faustino, Maria do Amparo Ferreira
Cavaleiro, José
Menezes, José Carlos Joaquim Maia de Souza
Keywords: Bioquímica
Porfirinas
Stresse oxidativo
Terapia fotodinâmica
Escherichia coli
Defense Date: 19-Dec-2013
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: A inativação fotodinâmica de microrganismos poderá constituir uma alternativa às modalidades antimicrobianas atuais. A inativação microbiana ocorre por combinação simultânea de luz, oxigénio e um agente fotossensibilizador. Através do processo de inativação fotodinâmica é possível destruir de forma eficaz diversos microrganismos patogénicos como bactérias, vírus, fungos e protozoários. Várias são as moléculas capazes de atuar como agentes fotossensibilizadores no entanto nem todas têm a capacidade de destruir eficientemente um largo espectro de microrganismos. Os derivados porfirínicos catiónicos têm demonstrado serem bons fotossensibilizadores na fotoinativação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, sem induzirem resistência bacteriana ao tratamento. Alguns destes derivados porfirínicos têm sido utilizados eficientemente na desinfeção de águas, pelo que a sua imobilização em suportes sólidos, que permitam a recuperação e reutilização do agente fotosensibilizador sem a libertação do mesmo no ambiente, é necessária. O presente trabalho teve como principal objetivo a preparação e imobilização em suportes sólidos (sílica e resina Merrifield) de derivados porfirínicos de tipo clorina e isobacterioclorina, e a avaliação da sua atividade antibacteriana na bactéria Gramnegativa Escherichia coli. A bactéria utilizada tratou-se de uma bactéria com capacidade bioluminescente, por introdução de genes de outra bactéria (Vibrio fischeri), o que permitiu avaliar em tempo real a capacidade antibacteriana de cada derivado em estudo. Todos os derivados preparados foram caraterizados estruturalmente com recurso a diversas técnicas espectroscópicas e a espectrometria de massa. Foi ainda determinada a capacidade de produção de oxigénio singleto, principal espécie responsável pela inativação bacteriana. Nos ensaios de fotoinactivação bacteriana utilizaram-se suspensões bacterianas de 107 UFC mL-1 (~ 105 URL), luz branca (380-700 nm) com uma potência de 40 W m-2 e concentrações de fotosensibilizador que variaram entre os 5,0 – 20 μmol dm-3 nos derivados não suportados e 10 – 200 μmol dm-3 para os derivados suportados. Os resultados mostram que a isobacterioclorina catiónica é o fotossensibilizador mais eficiente tendo originado, após 180 min de exposição à luz, uma diminuição de 5,0 log na bioluminescência quando na concentração de 20 μmol dm-3. Os restantes derivados não imobilizados, apesar de serem bons geradores de oxigénio singleto, não foram capazes de fotoinativar a bactéria gram-negativa em estudo, mesmo para a concentração mais elevada estudada (20 μmol dm-3) e após 180 min de exposição à luz. A imobilização em ambos os suportes (sílica e resina Merrifield) conferiu propriedades antibacterianas ao derivado de tipo clorina. Este estudo permitiu avaliar, pela primeira vez, a capacidade antibacteriana de derivados de tipo clorina e isobacterioclorina com carga positiva localizada apenas nas posições β-pirrólicas. Mais uma vez ficou evidente que o número de cargas positivas influencia a eficiência do fotossensibilizador. A imobilização em suportes do derivado do tipo clorina introduziu uma melhoria na capacidade antibacteriana. Por fim a possibilidade de recuperar e reutilizar o material fotossensibilizador permite encarar com grande expectativa a utilização desta metodologia como alternativa no tratamento e desinfeção de águas, mas também obter materiais antibacterianos para superfícies ou outras aplicações.
Photodynamic antimicrobial therapy can be an alternative to current antimicrobial modalities. The microbial inactivation occurs by simultaneous combination of light, oxygen and a photosensitizing agent. Through the photodynamic inactivation process it is possible to effectively destroy many pathogenic organisms such as bacteria, viruses, fungi and protozoa. Various molecules are able to act as photosensitizing agents however not all of them have the ability to effectively destroy a wide spectrum of microorganisms. Cationic porphyrin derivatives have proven to be good photosensitizers in the photoinactivation of Grampositive and Gram-negative bacteria, without inducing bacterial resistance to treatment. Some of these porphyrin derivatives have been used efficiently for the disinfection of water, so its immobilization on solid supports capable of the recovery and reuse of the photosensitizing agent without release into the environment is required. The aim of this study was the preparation and immobilization on solid supports (silica and Merrifield resin) of porphyrin derivatives of chlorin and isobacteriochlorin type, and to evaluate their antibacterial activity towards Gram-negative bacterium Escherichia coli. The bacterium used possesses a bioluminescent capacity by inserting genes from other bacteria (Vibrio fischeri), which allowed us to evaluate in real time the antibacterial ability of each derivative under study. All the derivatives prepared were structurally characterized using several spectroscopic techniques and mass spectrometry. It was also determined the production of singlet oxygen, the main species responsible for the bacterial inactivation. In the photoinactivation assays, bacterial suspensions of 107 UFC ml-1 (~105 URL), white light (380-700 nm) with an irradiance of 40 W m-2 and photosensitizing concentrations ranging between 5,0 - 20 μmol dm-3 for the non-immobilized photosensitizers and 10 - 200 μmol dm-3 for the immobilized ones were used. The results show that the cationic isobacteriochlorin is the most efficient photosensitizer, leading to a decrease of 5,0 log in bioluminescence at the concentration of 20 μmol dm-3 and after 180 min of light exposure. Although the other non-immobilized derivatives showed to be good singlet oxygen generators, they were not able to photoinactivate the gram-negative bacteria studied, even for the highest concentration tested (20 μmol dm-3) and after 180 min of light exposure. The immobilization on both supports (Merrifield resin and functionalized silica) conferred antibacterial properties to the chlorin-type derivative. This study allowed us to assess for the first time, the antibacterial ability of chlorin and isobacteriochlorin derivatives, with positive charges localized only in the β-pyrrolic positions. Once again it became clear that the number of positive charges influences the efficiency of the photosensitizer. The immobilization of chlorintype derivative on supports afforded materials with antibacterial activity. Finally, the possibility of recovering and reusing the photosensitizer material was checked, confirming that this method can be used as an alternative in water disinfection, but also to obtain new anti-bacterial materials for surfaces or others applications.
Description: Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares
URI: http://hdl.handle.net/10773/12575
Appears in Collections:DQ - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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