Expression and functionality of histone H2A2C in the mammary epithelium

Abstract

O cancro de mama é o tipo de cancro mais comumente diagnosticado entre as mulheres e também uma das primeiras causas de morte. Os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do cancro de mama são complexos e variam de individuo para individuo. Esta diversidade manifesta-se em alterações genéticas e/ou epigenéticas, tais como diferenças de padrões de expressão génica, aberrações cromossómicas, modificações de histonas e expressão diferencial de proteínas. Novos alvos e putativos biomarcadores para os tumores de mama invasivos são extremamente necessários e, uma vez que os padrões de expressão da histona H2A2C foram encontrados desregulados em células indiferenciadas este pode ser um bom objeto de estudo. Assim sendo, foram estudadas as diferenças de expressão de mRNA da histona H2A2C nos diferentes estados de diferenciação da linha celular epitelial mamária HC11 (proliferativa/ indiferenciadas, pre-diferenciado/competente e diferenciada/funcional) e de expressão de proteína por imunofluorescência. Para analisar a expressão de histona H2A2C na diferenciação da glândula mamária foi utilizada a técnica imunohistoquímica Além disso, para determinar se a expressão da H2A2C está associada a células em proliferação, utilizou-se a co-imunolocalização. A sequenciação por bissulfito foi utilizada para avaliar se a perda de expressão H2A2C nas células mais diferenciadas da linha celular HC11 estaria associada à metilação do promotor da histona H2A2C. E a técnica de ChIP ajudou-nos a estudar a interação das modificações pos-translaccionais das histonas (marcas activadoras: H3K36me2 e H3K79me3; marcas repressoras: H3K9me3 e H3K27me3) na região promotora da HistH2A2C. Uma vez que as células HC11 num estado mais indiferenciado são cultivadas em meio contendo EGF, com o intuito de verificar se as vias de sinalização Ras/Raf/MAPK e/ou PI3K/AKT/mTOR seriam responsáveis pela regulação da expressão da H2A2C, inibimos estas vias na linha celular HC11 e analisamos a sua expressão de mRNA e proteína por qRT-PCR e imunofluorescência, respectivamente. Adicionalmente, foram analisados os níveis de expressão da H2A2C numa série de casos de cancro da mama humano por qRT-PCR. Finalmente, estudou-se os efeitos fenotípicos do silenciamento da histona H2A2C nas linhas celulares HC11 e MC4L2 (carcinoma da mama). Foi observado que a expressão da histona H2A2C está relacionada com as células em estado estaminal da linha celular HC11 e a um estado de gravidez da diferenciação da glândula mamária de ratinho. Ao mesmo tempo, correlacionamos a expressão da histona H2A2C com a expressão do CD44 e do c - myc e a uma baixa expressão de E-caderina membranar, o que sugere que a histona H2A2C está relacionada não só com a indução da estaminalidade e proliferação, mas também com a repressão da diferenciação epitelial em células HC11. Esta última também foi confirmada por silenciamento do gene HIST2H2AC nas células HC11. O mecanismo de regulação da expressão da H2A2C ainda está por descobrir. No entanto, deixamos de lado a metilação do DNA como um evento putativo que poderia regular a expressão do gene que codifica a histona. Também, o papel da via PI3K/AKT na regulação da expressão H2A2C foi estabelecido. Finalmente, a expressão de H2A2C nos cancros da mama humanos foi confirmada. Em resumo, neste estudo, foram descritos pela primeira vez, a expressão e o papel da histona H2A2C quer no epitélio mamário quer no cancro da mama.

Breast cancer is the most common type of cancer diagnosed among women and also a leading cause of death. The mechanisms underlying the development of breast cancer are complex and vary between individual tumours. The diversity is manifested at either genetic and/or epigenetic alterations, such as differences in patterns of gene expression, chromosomal aberrations, modifications of histones and differential expression of proteins. New targets and putative biomarkers for invasive breast tumours are extremely needed and once that the expression of H2A2C has been found deregulated in undifferentiated cells this is thought to be a good study object. Therefore, we studied the differences of H2A2C mRNA expression in HC11 mammary epithelial cell line throughout differentiation (proliferative/undifferentiated, pre-differentiated/competent and functionally differentiated stages) by qRT-PCR and the protein levels by immunofluorescence. In order to study the expression of histone H2A2C in mammary gland differentiation we used immunohistochemistry. Furthermore, to establish if H2A2C expression is associated to cells undergoing mitosis/proliferation, we used co-immunolocalization. Bisulphite sequencing PCR was used to evaluate if loss of H2A2C expression in differentiated HC11 cells was associated to H2A2C promoter methylation. And ChIP helped us to study the interaction of post-translational histone modifications (activating marks: H3K36me2 and H3K79me3; repressive marks: H3K9me1 and H3K27me3) at the promoter region of HistH2A2C. Since HC11 cells in more undifferentiated stage are grown in medium containing EGF, with the intention to verify if the Ras/Raf/MAPK and/or PI3K/AKT/mTOR pathways were responsible for regulation of H2A2C expression we inhibited these pathways in HC11 cell line and analysed their mRNA and protein expression by qRT-PCR and immunofluorescence, respectively. In addition, we analysed the expression levels of H2A2C in a series of cases of human breast cancers by qRT-PCR. Finally, we studied the phenotypic effects of H2A2C silencing in HC11 and MC4L2 (mammary carcinoma) cell lines. Herein, we demonstrate that the histone H2A2C expression is related to stem-cell like stage in HC11 cells and to a pregnant state of mouse mammary gland differentiation. At the same time, we correlated the H2A2C expression to CD44 and c-myc expression and to a down-expression of membranous E-cadherin, suggesting that the histone H2A2C is related not only to the induction of steamness and proliferation but also to the repression of differentiation in HC11 cells. Latter, this was also confirmed by silencing HIST2H2AC in HC11 cells. The regulation of expression of H2A2C is still to be discovered. However, we were able to rule out DNA methylation as a putative event that could regulate the HIST2H2AC expression. Also, the role of PI3K/AKT pathway in regulating H2A2C expression was established. Finally, the expression of H2A2C in human breast cancers was confirmed. In summary, in this study, we report for the first time the expression and the role of the histone H2A2C in mammary epithelium and in breast cancer.