The effect of pyruvate accumulation on whole yeast cell transamination

Abstract

O interesse na biocatálise para a síntese de aminas quirais tem aumentado durante a última década. Tal interesse deve-se ao seu potencial para síntese de fármacos cardiovasculares, anti-hipertensivos e antieméticos tal como para a síntese de ácidos carboxílicos oticamente puros. Dois métodos têm sido reportados para a síntese de aminas quirais por ómegatransaminases: a síntese assimétrica e a resolução cinética. Durante a resolução cinética o piruvato é consumido como aceitador de amina e convertido em L-alanina. A acumulação de piruvato da via glicolítica pode fazer-se por Engenharia metabólica, originando o aumento da velocidade da reacção para a formação da respectiva cetona. Piruvato descarboxilase (PDC) é a enzima responsável pela conversão de piruvato em acetaldeído que por sua vez é o percursor do etanol. Estudos anteriores mostram que a acumulação de piruvato é superior através da inibição ou deleção da PDC. Seguiram-se duas abordagens para inibir a PDC sendo uma a deleção de dois genes estruturais, PDC1 e PDC5, e a outra a deleção do gene THI2 que é responsável pela síntese do co-factor da PDC, tiamina. Neste trabalho a ω-transaminase de Capsicum chinense foi expressa em estirpes de S. cerevisiae manipuladas metabolicamente, para acumulação de piruvato, de forma a melhorar a resolução cinética de uma mistura racémica de R,S-feniletilamina (R,S-PEA). Ambas as estirpes foram construídas com sucesso e confirmadas por PCR e comportamentos fenotípicos. Porém, apenas a estirpe com a deleção de THI2 foi isolada e mantida em glycerol com sucesso. A concentração de tiamina durante a cultura préfermentativa demonstrou ser crucial para a acumulação de piruvato durante as fermentações. A concentração mínima de tiamina, de forma a obter um bom rácio entre obtenção de biomassa e acumulação de piruvato foi de 0.05 μM. Realizaram-se fermentações anaeróbicas e aeróbicas em meio Verduyn, contendo 20 g/L e 50 g/L de glucose, para confirmar o fenótipo de acumulação de piruvato e para verificar o efeito da concentração de tiamina. A acumulação máxima de piruvato atingida em meio Verduyn foi de 1.31 g/L. A acumulação de piruvato aumentou 5,7 vezes em comparação a estirpe controlo durante fermentações anaeróbicas contendo células obtidas em meio com a concentração mínima de tiamina. Após confirmação do fenótipo desejado, realizaram-se fermentações anaeróbicas e aeróbicas e verificou-se a resolução cinética de R,S-PEA em tampão fosfato. O fenótipo de acumulação de piruvato também foi observado em tampão fosfato, contudo, a resolução cinética não foi afetada possivelmente por uma concentração inicial de aminas demasiado baixa.

The interest in biocatalytic approaches for the synthesis of chiral amines has increased during the last decades due to their potential in the synthesis of cardiovascular, antihypertensive and antiemetic drugs and for the preparation of optically pure carboxylic acids. Two methods have been reported for the synthesis of chiral amines by ω- transaminases: asymmetric synthesis and kinetic resolution. During kinetic resolution pyruvate is required as amine acceptor and is further converted into L-alanine. Pyruvate is the end metabolite of the glycolytic pathway. In Saccharomyces cerevisiae, pyruvate is further catabolized using either pyruvate decarboxylase (PDC) that converts pyruvate into acetaldehyde that is the precursor of ethanol or via pyruvate dehydrogenase (PDH). The inhibition or deletion of PDC has been reported to promote pyruvate accumulation. In the present study, two approaches were followed to decrease the PDC activity: (i) deleting the major structural encoding genes, PDC1 and PDC5, or (ii) deleting THI2 which encodes the enzyme responsible for the synthesis of PDC’s co-factor thiamine. Both strategies were attempted in a S. cerevisiae strain carrying the ω- transaminase from Capsicum chinense for the kinetic resolution of a R,S-phenylethylamine racemate (R,S-PEA). The desired strains were successfully constructed and confirmed through PCR and phenotypic behaviors. However, only the THI2 deleted strain expressing the heterologous ω-transaminase was successfully isolated. The thiamine concentration during growth prior to fermentation was crucial for the pyruvate accumulation during the fermentations. The minimal thiamine concentration to achieve a good ratio between pregrowth and pyruvate accumulation was 0.05 μM. Anaerobic fermentations and aerobic cultivations were performed in Verduyn medium to confirm the pyruvate accumulative phenotype and screen the thiamine concentration effect with 20 g/L and 50 g/L of glucose. The maximum pyruvate titer of 1.31 g/L was achieved. The pyruvate titer was improved 5.7 when compared to the control strain during anaerobic fermentations in Verduyn medium. After confirmation of the desired phenotype, kinetic resolution of R,S-PEA was performed in phosphate buffer under anaerobic and aerobic conditions. Despite increased pyruvate accumulation, the kinetic resolution was not improved possibly due to a low initial amine concentration. The reasons for such assumption are related with similar ethanol titers observed in kinetic resolution reactions and pyruvate accumulation fermentations and also the residual pyruvate accumulation during kinetic resolution reactions.