Nanosensor for assessing the risk of a cardiovascular disease

Abstract

The incidence of cardiovascular diseases (CVD) has been increasing according to the European and global statistics. Thus, the development of new analytical devices, such as biosensors for assessing the risk of CVD could become a valuable approach for the improvement of healthcare service. In latest years, the nanotechnology has provided new materials with improved electronic properties which have an important contribution in the transduction mechanism of biosensors. Thus, in this thesis, biosensors based on field effect transistors with single-walled carbon nanotubes (NTFET) were developed for the detection of C-reactive protein (CRP) in clinical samples, that is, blood serum and saliva from a group of control patients and a group of CVD risk patients. CRP is an acute-phase protein, which is commonly known as the best validated biomarker for the assessment of CVD, the single-walled carbon nanotubes (SWCNT) were applied as transduction components, and the immunoreaction (interaction between the CRP antigen and the antibodies specific to CRP) was used as the mechanism of molecular recognition for the label-free detection of CRP. After the microfabrication of field effect transistors (FET), the screening of the most important variables for the dispersion of SWCNT, the assemblage of NTFET, and their application on standard solutions of CRP, it was found that NTFET respond accurately to CRP both in saliva and in serum samples, since similar CRP levels were found with the NTFET and the traditional methodology (ELISA technique). On the other hand, a strong correlation between salivary and serum CRP was found with NTFET, which means that saliva could be used, based on non-invasive sampling, as an alternative fluid to blood serum. It was also shown that NTFET could discriminate control patients from CVD risk patients, allowing the determination of a cut-off value for salivary CRP of 1900 ng L-1, which corresponds to the well established cut-off of 3 mg L-1 for CRP in serum, constituting an important finding for the possible establishment of a new range of CRP levels based on saliva. According to the data provided from the volunteer patients regarding their lipoprotein profile and lifestyle factors, it was concluded that the control and the CVD risk patients could be separated taking into account the various risk factors established in literature as strong contributors for developing a CVD, such as triglycerides, serum CRP, total cholesterol, LDL cholesterol, body mass index, Framingham risk score, hypertension, dyslipidemia, and diabetes mellitus. Thus, this work could provide an additional contribution to the understanding of the association of biomarkers levels in serum and saliva samples, and above all, cost-effective, rapid, label-free, and disposable NTFET were developed, based on a noninvasive sampling, for the assessment of CVD risk, thus constituting a potential point-of-care technology.

A incidência de doenças cardiovasculares (CVD) tem vindo a aumentar de acordo com as estatísticas europeias e globais. Assim, o desenvolvimento de novos dispositivos analíticos, tais como os biossensores para avaliar o risco de CVD pode constituir uma ferramenta valiosa para a melhoria dos cuidados de saúde. Nos últimos anos, a nanotecnologia tem proporcionado a criação de novos materiais com excelentes propriedades eletrónicas que têm uma contribuição importante no mecanismo de transdução dos biossensores. Assim, nesta tese, foram desenvolvidos biossensores com uma configuração de transístores de efeito de campo com nanotubos de carbono de parede simples (NTFET) para deteção da proteína C-reactiva (CRP) em amostras biológicas, isto é, soro e saliva de um grupo de pacientes controlo e de outro com pacientes que sofrem de doenças que afetam os níveis de CRP (grupo de risco de CVD). A CRP é uma proteína de fase aguda que é conhecida como o melhor marcador validado para a deteção de risco de CVD, os nanotubos de parede simples (SWCNT) foram aplicados como parte do componente de transdução e a imunorreação, ou seja, a interação entre a CRP e o seu anticorpo específico, foi utilizada como mecanismo de reconhecimento molecular para a deteção da CRP. Após a microfabricação dos transístores de efeito de campo (FET), a seleção das variáveis mais importantes para a dispersão dos SWCNT, a montagem dos NTFET, e a aplicação dos NTFET a soluções padrão de CRP, verificou-se que os dispositivos respondem com precisão à CRP, tanto nas amostras de soro como nas de saliva, uma vez que os NTFET e a metodologia de referência (ELISA) determinaram níveis semelhantes de CRP. Por outro lado, uma forte correlação foi encontrada entre os níveis de CRP em soro e saliva determinados com os NTFET, o que significa que a saliva pode ser utilizada, com base numa amostragem nãoinvasiva, como alternativa ao soro. Estes dispositivos conseguem ainda discriminar os pacientes do grupo de controlo e os do grupo de risco tendo por base os níveis de CRP na saliva, permitindo assim a determinação de um nível de corte para a CRP na saliva de 1900 ng L-1, que corresponde ao nível de corte estabelecido para a CRP no soro de 3 mg L-1, havendo assim a possibilidade de estabelecer uma nova gama de valores para os níveis de CRP na saliva. Tendo em conta os resultados obtidos a partir do perfil lipoproteico e dos hábitos de vida, concluiu-se que os pacientes do grupo de controlo e os do grupo de risco de CVD podem ser separados com base nos fatores de risco já estabelecidos na literatura e que contribuem para o desenvolvimento de CVD, tais como os triglicerídeos, a CRP do soro, o colesterol total, o colesterol LDL, o índice de massa corporal, a pontuação de Framingham, a hipertensão, a dislipidemia, e a diabetes mellitus. Assim, este trabalho relata o desenvolvimento de dispositivos de baixo custo, rápidos, descartáveis, e sem a presença de marcadores para a deteção da CRP, com base numa amostragem não-invasiva, para avaliação de risco de CVD podendo constituir um avanço nos cuidados de saúde.

L’incidence des maladies cardiovasculaires (CVD) a augmentée selon les dernières statistiques européennes et mondiales. Ainsi, le développement de nouveaux appareils d’analyse, tels que les biocapteurs pour évaluer le risque de CVD pourrait être une approche intéressante pour l’amélioration des services de santé. Dans les dernières années, la nanotechnologie a fourni de nouveaux matériaux avec d’excellentes propriétés électroniques qui ont une contribution importante pour le mécanisme de transduction des biocapteurs. Ainsi, dans cette thèse, les biocapteurs basés sur des transistors à effet de champ avec des nanotubes de carbone monofeuillet (NTFET) ont été développés pour la détection de la protéine C-réactive (CRP) dans des échantillons de sérum et de salive d’un group de patients de contrôle et un autre groupe de patients avec un risque élevé de développer une CVD. La CRP est une protéine de phase aiguë qui est connu comme le meilleur biomarqueur validé pour la détection de CVD, les nanotubes de carbone monofeuillet (SWCNT) on été appliqués comme parti de l’élément de transduction, et la réaction immunologique (interaction entre l’antigène CRP et ses anticorps spécifiques) a été utilisée comme le mécanisme de reconnaissance moléculaire pour la détection de la CRP. Après la microfabrication des transistors à effet de champ (FET), la sélection des variables les plus importantes pour la dispersion des SWCNT, l’assemblage des NTFET, et leur application sur des solutions de CRP, il a été constaté que les dispositifs de NTFET on répondu précisément à la CRP tant dans les échantillons de sérum comme dans ceux de salive, une fois que les NTFET et la méthodologie traditionnelle (technique d’ELISA) ont déterminés des taux similaires de CRP. D’autre part, une forte corrélation entre la CRP de la salive et du sérum a été trouvée avec les NTFET, ce que signifie que la salive, qui demande un échantillonnage non-invasif, pourrait être utilisée comme une alternative au sérum. Il a été également démontré que les NTFET on la possibilité de discriminer les patients de contrôle des patients de risque de CVD, permettant la détermination d’un taux limite pour la CRP salivaire de 1900 ng L-1, qui correspond au taux limite de 3 mg L-1, celui-ci bien établi pour la CRP dans le sang, ce qui constitue un résultat important pour l’éventuelle création d’une nouvelle gamme de taux de CRP basée sur la salive. Selon les données fournies par les patients volontaires concernant leur profil de lipoprotéines et des facteurs de style de vie, les patients de contrôle et de risque de CVD ont étés séparé pris en compte les différents facteurs de risque établis dans la littérature comme contribuant fortement pour le développement de CVD, tels que les triglycérides, la CRP, le cholestérol total et LDL, l’indice de masse corporelle, le score de Framingham, l’hypertension, la dyslipidémie, et les diabètes. Ainsi, cette thèse rapporte le développement de dispositifs peu couteux, rapide, jetable et sans la présence de marqueurs pour la détection de la CRP, basées sur un échantillonnage non-invasif, pour l’évaluation du risque de CVD, pouvant être une percée dans les soins de santé.