Establishing model systems from olfactory mucosa stem cells

Abstract

As células estaminais são uma classe distinta de células, devido às suas capacidades de regeneração e diferenciação em vários tipos de células especializadas. Os nichos onde estas se encontram servem-lhes de sustentação e permitem a sua manutenção num estado indiferenciado, afectando a sua regeneração e diferenciação através de estímulos. As células estaminais dividem-se em duas classes: embrionárias (pluripotentes) e adultas (multipotentes), embora também existam células estaminais pluripotentes induzidas. Nos últimos anos tem-se estudado a possibilidade de utilizar sistemas baseados em células estaminais no estudo de neuropatologias. Assim sendo, os objectivos desta dissertação foram o isolamento e proliferação de células estaminais da mucosa olfactiva, a indução destas células para a formação de neurosferas e a sua diferenciação para células tipo neuronais (NLC) e células derivadas de neurosferas (ONS). Também se procedeu à diferenciação das ONS e à caracterização dos modelos celulares NLC e ONS. Para se atingir os objectivos definidos, foram recolhidas biópsias de mucosa olfactiva e isolaram-se células estaminais de epitélio e da lâmina própria. As células estaminais da mucosa olfactiva proliferaram e foram induzidas a formar neurosferas com um meio de cultura específico (DMEM/F12 com ITS-X, EGF e FGF2). As neurosferas foram posteriormente diferenciadas em células ONS (com meio DMEM/F12) e em NLC (com meio neurobasal suplementado com NGF, B27, glutamina e glutamato). Imagens obtidas durante o tempo de diferenciação das NLC foram analisadas tendo em conta parâmetros morfométricos. As células ONS foram adaptadas à cultura em meio sem soro e diferenciadas em células tipo neurónios (usando meio DMEM/F12 com N2 e meio DMEM/F12 com B27). Os resultados obtidos indicam que estabelecemos culturas primárias de células estaminais da mucosa olfactiva de rato. A eficiência dos protocolos de isolamento e proliferação foi confirmada pela marcação com nestina através de imunofluorescência e pela formação de neurosferas. A análise morfométrica das NLC indicou que diferenciámos as neurosferas para células tipo neuronal, devido à sua morfologia neuronal e à expressão do marcador neuronal β-tubulina III. Foram também estabelecidas culturas de células ONS, posteriormente diferenciadas através da redução de soro, apresentando um fenótipo tipo neuronal quando mantidas em meio definido. Contudo, devem ser realizadas experiências futuras para a caracterização deste novo modelo celular. Os nossos resultados permitem-nos concluir que estabelecemos e caracterizámos novos sistemas modelo baseados em células estaminais. Estes resultados são relevantes uma vez que tais modelos podem ser usados para o estudo de mecanismos celulares e moleculares envolvidos em inúmeras neuropatologias, nomeadamente na Doença de Alzheimer.

Stem cells are a distinct class of cells, characterized by their ability to self-renew and differentiate into several specialized cell types. The niche of stem cells provides them support, favors their existence in an undifferentiated state and affects, by stimuli, their self-renewal and cellular fate. Stem cells can be divided in two broad classes: embryonic (pluripotent) and somatic stem cells (multipotent), although induced pluripotent stem cells are also a reality nowadays. The possibility of investigating neuropathologies using stem cell based systems has attracted interest among researchers in the last few years. Therefore, the main objectives of this dissertation were the isolation and proliferation of olfactory mucosa stem cells that were further induced to form neurospheres and further differentiated into neuron-like cells (NLC) and olfactory neurosphere-derived cells (ONS). ONS differentiation and the characterization of NLC and ONS model systems were also performed. For the accomplishment of these objectives, olfactory mucosa biopsies were collected and epithelium and lamina propria stem cells isolated. The well proliferating olfactory mucosa stem cells were induced to form neurospheres using a specific culture medium (DMEM/F12 supplemented with ITS-X, EGF and FGF2). The neurospheres were then differentiated into ONS cells (using DMEM/F12 medium) and into NLC (using neurobasal medium supplemented with NGF, B27, glutamine and glutamate). Morphometric analysis of neuron-like cells was performed on microphotographs taken at several time points during the differentiation procedure. ONS cells were adapted to serum deprivation and differentiated into neuronal-like cells (using DMEM/F12 with N2 medium and DMEM/F12 with B27 medium). Our results indicate that we successfully established primary rat cultures from olfactory mucosa stem cells. The efficiency of the isolation/proliferation procedure was confirmed by positive immunostaining with stemness marker nestin and also by their ability to form neurospheres. The morphometric analysis of NLC revealed that we successfully differentiated neurosphere-forming cells into neuron-like cells, since they assume a neuronal like phenotype and they highly express the neuronal marker β-tubulin III. Additionally, ONS cultures were established and further differentiated by gradual serum deprivation. In fact, these cells presented neuronal-like phenotypic characteristics when cultured in defined medium. However, additional experiments for characterization of this new model system should be performed. From our results we can conclude that we efficiently established and characterized new stem cells model systems. These results are of paramount importance since they will be used for the study of cellular and molecular mechanisms underlying several neuropathologies, including Alzheimer’s disease